马 雷，程立坤，徐庆阳，陈 宁

(1. 天津科技大学电子信息与自动化学院，天津 300222；2. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

L–异亮氨酸(Ile)是人体8种必需氨基酸之一，又是3种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能而在人类生命代谢中具有特别重要的地位．L–异亮氨酸除用于一般营养型复合氨基酸输液，还大量用于配制治疗型特种氨基酸输液如肝安、肾安氨基酸输液，对治疗各种肝脏疾病具有显著疗效[1]．随着 L–异亮氨酸市场需求量的增加，人们对发酵生产 L–异亮氨酸进行了深入研究．代谢流分析(Metabolic Flux Analysis，MFA)定量地描述了代谢网络中各个支路的流量分配关系，有助于分析目的产物的合成过程的瓶颈，对于理解细胞的代谢调控机制有重要意义．

常高峰等[2]通过对黄色短杆菌生产 L–异亮氨酸的发酵代谢分析得出，在 L–异亮氨酸的发酵过程中有缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸及乳酸等杂酸积累，副产物的生成造成了碳源的浪费．在生物合成过程中，当EMP途径通量超出 TCA循环的代谢能力时，会使EMP途径生成的丙酮酸积累，则会导致酸及副产物的生成．有研究表明[3]，在发酵过程中添加柠檬酸钠，可适当减少 EMP途径的代谢流量，降低副产物的生成．本文考察了添加不同浓度的柠檬酸钠对 L–异亮氨酸发酵的影响，旨在确定柠檬酸钠最适的添加量；并采用代谢流分析方法，定量地描述了柠檬酸钠添加前后黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)WYJ1合成L–异亮氨酸代谢流的分布．这有利于采取相应措施，改造菌种及优化发酵过程控制，为进一步提高 L–异亮氨酸的得率提供理论依据．

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与培养基

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)WYJ1(Met-＋AECr＋α-ABr)为天津科技大学代谢工程研究室保藏菌种．

培养基组成参见文献[4]．

1.1.2 主要仪器

发酵罐(5 L、30 L全自动发酵罐)，上海保兴生物设备工程有限公司；SBA–40C型生物传感仪，山东科学院生物研究所；pH电极和溶氧电极，Mettler Toledo；Agilent 1200型高效液相色谱仪，Agilent Technologies；DZF–6020型真空干燥箱，上海博迅实业有限公司；FA2204B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司．

1.2 培养方法

斜面菌种活化培养：取斜面保藏菌种划线接种于活化斜面，31,℃恒温培养24,h．

5,L种子罐培养：吸取适量无菌生理盐水于 5支活化斜面中，将所有菌悬液接入 5,L种子罐中．初始通气量1,L/min，搅拌转速 300～600,r/min，通过自动流加氨水控制 pH(7.0±0.2)，培养温度 31,℃，以泡敌消泡，培养10,h后，按10%接种量接入发酵培养基中．

30,L发酵罐培养：按 10%接种量将种子液接入30,L发酵罐中，初始通气量 2,L/min，搅拌转速400～800,r/min，通过自动流加氨水控制 pH(7.0±0.2)，培养温度31,℃，以泡敌消泡，发酵培养65,h．

1.3 分析方法

菌体生物量：菌体生物量以菌体干重(g/L)表示，取10,mL发酵液，10,000,r/min离心20,min，将菌体用蒸馏水洗涤 2次后置于真空干燥箱中，80,℃干燥至恒质量，用分析天平称量．

溶氧及pH：在线测定．

葡萄糖和乳酸浓度：采用 SBA–40C型生物传感仪测定．

L–异亮氨酸及其他氨基酸含量：L–异亮氨酸及其他氨基酸含量采用高效液相分析系统测定．色谱分离条件：Agilent C18(150,mm×4.6,mm，3.5,µm)为色谱分离柱，2，4–二硝基氟苯柱前衍生测定，乙腈与NaAc溶液进行梯度洗脱，流动相流量 1,mL/min，检测波长360nm．

1.4 数据处理

发酵过程中菌体比生长速率 μ按照公式(1)计算：

式中：X、x均为菌体量；t为时间．用Origin绘图软件对实验数据进行微分计算，再用 Excel软件求解不同时刻的μ．

2 结果与分析

2.1 L–异亮氨酸生物合成途径分析

根据文献报道[5]，在黄色短杆菌中L–异亮氨酸生物合成的中心代谢途径包括 EMP、TCA及 HMP途径，而乙醛酸途径封闭或微弱．L–异亮氨酸生物合成的代谢网络如图1所示．由图1可知，由葡萄糖合成L–异亮氨酸的途径较长且复杂．王健等[6]通过对 L–异亮氨酸的代谢途径分析得出：减弱 TCA循环和乙醛酸支路，可以使更多的碳架流转向异亮氨酸的合成．并且宋文军等[7]研究表明，在 L–异亮氨酸生物合成中，若 TCA 途径流量过大，会导致 L–异亮氨酸的代谢流减少．故减弱 TCA途径，可以提高发酵过程中 L–异亮氨酸产酸水平．Majewsi和 Domach[8]用限制性网络分析和相关酶活相关联的代谢流，指出在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中EMP途径相对于TCA循环要过量，当EMP途径通量超出TCA循环的代谢能力时，致使EMP途径生成的丙酮酸积累，且会通过其他途径进行代谢以缓解持续的“溢流”，导致酸及副产物的生成．有研究表明[3]，在利用黄色短杆菌发酵生产 L–亮氨酸过程中，当 EMP途径流量超出 TCA及 L–亮氨酸生物合成的代谢能力时，丙酮酸代谢受阻，从而通过其他途径进一步代谢，导致副产物生成．因此，发酵生产L–异亮氨酸的过程中，减弱EMP途径代谢流量，降低副产物的生成及控制 TCA循环流量，是提高 L–异亮氨酸得率的关键．刘新星等[9]通过研究柠檬酸钠对枯草芽孢杆菌生产肌苷的影响得出，添加柠檬酸钠可以显著降低丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，从而减弱 EMP途径通量．同时，柠檬酸钠会竞争性抑制柠檬酸合成酶的活性．因此，在L–异亮氨酸发酵过程中添加柠檬酸钠，可有效减弱EMP途径及TCA循环的代谢流量．

图1 黄色短杆菌L–异亮氨酸生物合成代谢网络Fig.1 Biosynthesis metabolism pathway of L-isoleucine in Fig.1 Brevibacterium flavum

2.2 柠檬酸钠对L–异亮氨酸发酵的影响

2.2.1 柠檬酸钠对发酵副产物的影响

宋翔等[10]研究表明，在谷氨酸发酵中添加柠檬酸钠可适当减少 EMP途径的代谢流量，降低副产物乳酸、L–丙氨酸、L–赖氨酸的生成．L–异亮氨酸属天冬氨酸族，又是分支链氨基酸，其生物合成存在严格的细胞内反馈调节抑制，不可能过量积累，且复杂的调控机制使得 L–异亮氨酸发酵产物中存在有机酸及其他氨基酸等副产物．发酵过程中副产物的生成造成了碳源的浪费及 L–异亮氨酸合成流量的减少．因此，减少副产物的生成可有效提高 L–异亮氨酸产率．分别向发酵培养基中添加 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L 的柠檬酸钠进行 L–异亮氨酸分批发酵，发酵过程中副产物含量如图2所示．由图2可知，在L–异亮氨酸发酵过程中添加柠檬酸钠可有效减少副产物的生成，且随着柠檬酸钠添加量的增加，副产物含量逐渐降低，但是降低幅度逐渐减小．

图2 柠檬酸钠对L–异亮氨酸发酵副产物的影响Fig.2 Effect of sodium citrate on byproducts of Fig.欢会 L-isoleucine fermentation

2.2.2 柠檬酸钠对菌体比生长速率及生物量的影响

柠檬酸钠对生物合成途径中关键酶如磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶及柠檬酸合成酶等存在抑制作用，则在发酵过程中添加柠檬酸钠会抑制菌体生长[9]．在L–异亮氨酸分批发酵中，柠檬酸钠对菌体生长的影响如图3所示．

图3 柠檬酸钠对菌体比生长速率及生物量的影响Fig.3 Effect of sodium citrate on the specific growth rate Fig.3 and biomass

由图 3可知，柠檬酸钠添加量为 1.0、2.0,g/L与未添加时，菌体比生长速率及生物量差异不大．而添加量为3.0,g/L时，菌体比生长速率及生物量降低，且随着添加量的增加逐渐降低．

2.2.3 柠檬酸钠对L–异亮氨酸产量的影响

在发酵培养基中添加柠檬酸钠可减少副产物生成，即副产物的代谢流量减少可使 L–异亮氨酸的代谢流量增加．有研究表明[10]，向L–谷氨酸发酵过程中添加柠檬酸钠，可增加 L–谷氨酸生物合成的代谢流，提高 L–谷氨酸产酸水平．而谷氨酸是异亮氨酸合成的前体物，则谷氨酸的增加利于 L–异亮氨酸的合成．发酵过程中添加柠檬酸钠对 L–异亮氨酸产量的影响如图4所示．

图4 柠檬酸钠对L–异亮氨酸产量的影响Fig.4 Effect of sodium citrate on the yield of L-isoleucine

由图4可知，当柠檬酸钠添加量为2.0,g/L时，产酸水平最高，为25.63,g/L，与未添加相比提高了 7.87%．但是柠檬酸钠添加量高于 3.0,g/L时，L–异亮氨酸产酸水平逐渐下降，这可能是柠檬酸钠对生物合成途径中关键酶的抑制作用造成的．

综上所述，当柠檬酸钠添加量为 2.0,g/L，可有效减少发酵过程中副产物的生成，且对 L–异亮氨酸生产菌的生长影响较小，同时使 L–异亮氨酸的产量得到提高．故在 L–异亮氨酸发酵中，柠檬酸钠的最适添加量为2.0,g/L．

2.3 柠檬酸钠添加前后代谢流量分析

在发酵培养基中添加或未添加 2.0,g/L柠檬酸钠，分别对其发酵中后期进行代谢流量分析．由图 3可知，L–异亮氨酸发酵过程中 36,h后菌体干重基本没有变化，说明发酵进入中后期．测定36～60,h葡萄糖、4 种氨基酸(L–异亮氨酸、L–缬氨酸、L–亮氨酸、L–丙氨酸)和乳酸的含量，并对其变化速率和代谢流进行计算，结果见表1．

表1 柠檬酸钠添加前后代谢产物变化速率及代谢流量Tab.1 Variation rate and metabolic flux of metabolites without or with sodium ciltrate

由表 1可以看出，添加柠檬酸钠后，降低了副产物 L–缬氨酸、L–亮氨酸、L–丙氨酸及乳酸的代谢流量，提高了L–异亮氨酸的代谢流量．同时，加入柠檬酸钠以后，葡萄糖的消耗速率降低，这与文献[9]所得出的结论“柠檬酸钠降低了枯草芽孢杆菌的耗糖速率”相一致．但是，L–异亮氨酸的生成速率增加，这说明加入柠檬酸钠可以提高 L–异亮氨酸发酵中的糖酸转化率．

利用MATLAB软件中的Linprog函数计算得到柠檬酸钠添加前后 L–异亮氨酸发酵中后期的代谢流量分布，其结果分别如图5和图6所示．

由图 5和图 6可知，添加柠檬酸后生成副产物Val、Leu、Ala及 Lac的代谢流均有所降低，分别降低了40.91%、14.26%、48.84%、8.78%．而进入L–异亮氨酸生物合成途径的代谢流较未添加前提高了 5.91%．由于分支链氨基酸的合成需要谷氨酸提供氨基，则谷氨酸合成的代谢流量较大．未添加柠檬酸钠时进入HMP、EMP的代谢流量分别为 36.66、63.34，添加后HMP途径的代谢流量为 53.46，EMP代谢流量为46.54．则可知，添加柠檬酸钠可以减弱 EMP途径代谢流量，增加 HMP途径代谢流量，这与文献[3]报道的柠檬酸钠对产 L–亮氨酸黄色短杆菌代谢流分布的影响作用一致．HMP途径的主要作用是L–异亮氨酸合成途径提供还原力 NADPH．HMP途径流量增加，从而还原力 NHDPH 生成量增加，有利于 L–异亮氨酸的合成．柠檬酸钠添加后，TCA循环的代谢流量有所降低，由于柠檬酸钠合成酶是TCA循环的限速酶，添加柠檬酸钠会对柠檬酸钠合成酶活性产生抑制作用．因此，在 L–异亮氨酸发酵过程中添加柠檬酸钠，可有效减弱EMP途径及TCA循环的代谢流量，减少副产物的生成及提高 L–异亮氨酸合成的代谢流量，有利于L–异亮氨酸发酵．

图5 未添加柠檬酸钠时L–异亮氨酸合成代谢流量分布Fig.5 Metabolic flux distribution of L-isoleucine fermen-Fig.5 tation without addition of sodium citrate

图6 添加柠檬酸钠后L-异亮氨酸合成代谢流量分布Fig.6 Metabolic flux distribution of L-isoleucine fermen-Fig.6 tation with addition of sodium citrate

3 讨 论

代谢网络是一个复杂的反应体系，要提高目的产物的产率，中心代谢途径与产物合成途径所组成的代谢网络的限速反应是关键．王健等[6]对 L–异亮氨酸的代谢途径进行分析，通过对基本模型的分析，确定了 L–异亮氨酸生物合成最优的代谢途径．通过引导最优途径中各个关键酶成比例的过量表达，在不破坏整个代谢途径的情况下，可提高 L–异亮氨酸产率，防止碳源的浪费．在代谢途径分析的指导下，通过优化培养基及控制工艺条件，使 L–异亮氨酸产酸水平得到提高．经酶学性质研究表明[9]，柠檬酸钠的添加降低了EMP途径中关键酶PFK和PK的活力，从而引起糖酵解过程酶反应速率减慢，通量减少，同时 HMP途径的关键酶 6–磷酸葡萄糖脱氢酶的活力有所增加．则在 L–异亮氨酸发酵中添加柠檬酸钠可以减弱EMP途径，且可以增加还原力NADPH的供应，有利于提高 L–异亮氨酸的产率．本文利用代谢流分析法分析 L–异亮氨酸发酵中后期的代谢流量分布，可为菌株构建及发酵工艺研究提供理论依据，对 L–异亮氨酸规模化生产有一定指导意义．

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［3］ 陈宁，刘辉. 柠檬酸钠对 L-亮氨酸发酵代谢流分布的影响[J]. 高校化学工程学报，2008，22(3)：478-482.

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