张志宇 ，张佳敏 ，王卫 ,*，付晓 ，郭秀兰 ，李翔

（1.西华大学生物工程学院，四川 成都 610039；2.成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川 成都 610106）

胰酶酶解猪骨素的工艺条件

张志宇1，张佳敏2，王卫2,*，付晓1，郭秀兰2，李翔2

（1.西华大学生物工程学院，四川 成都 610039；2.成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川 成都 610106）

利用胰酶酶解猪骨素并测定其酶解液的水解度。通过单因素试验确定胰酶水解猪骨素的酶解温度、pH值、酶用量、料液比（底物浓度）及水解时间，在此基础上用正交试验分析酶解的最佳工艺，在本试验条件下，酶解的最佳工艺为在温度45℃，pH7.5，酶用量8750U/g以及料液比1∶12.5g/mL条件下酶解3h，此条件下水解度可以达到25.00%。

骨素；胰酶；酶解；工艺

我国的肉类总产量近6000万t，约占世界肉类总产量的1/4[1]，每年因生产肉类而产出的畜禽骨近2000万t。产出的畜禽骨一般被用于加工骨胶、骨油、骨粉等，或作为工业原料、动物饲料和肥料[2]，利用方式比较粗放，而且骨制产品的附加值很低[3]，不仅造成资源的浪费，而且给环境保护带来沉重的负担[4-5]。

畜禽骨的开发利用起步较晚，20世纪80年代才在世界上受到重视。但是由于资金、技术以及消费者对骨食品认识的欠缺等因素，我国的骨食品开发处于比较落后的水平。提高畜禽骨的综合利用率，加快畜禽骨加工制品的优质化，已成为提高我国农牧业水平和农产品加工效益、实现清洁化生产及可持续发展的关键。应用现代酶解技术，将畜禽骨加工为高附加值产品，已是国内外肉类行业发展的必然趋势。

骨素提取加工是畜禽骨高效利用的重要途径，其主要利用方式之一是制取天然调味料，畜禽骨经清洗、蒸煮提取、浓缩等制得，其中蛋白酶对原料提取液进行水解，得到有一定水解度的溶液，对提高原料中游离氨基酸的含量，增加美拉德反应中生香前驱物质量，强化产品的显味能力具有重要作用。在用蛋白酶水解骨素时，酶解条件对产品的呈味作用很重要，因此骨素的酶解工艺得到广泛关注，已有利用蛋白酶等对畜禽骨泥水解的研究报道[6]，但是对于较佳酶解工艺条件以及不同蛋白酶的比较研究仍然较少，为此本文研究了胰酶酶解猪骨骨素的工艺条件，为畜禽骨高效利用提供更充分的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

骨素由四川省乐山市天添食品有限公司提供（由猪骨经蒸煮提取制得）；胰酶购于北京华瑞新成科技有限公司（酶活力250000 U/g）。

1.2 试验方法

先通过单因素试验确定胰酶水解猪骨素时最佳酶解温度、pH值、酶用量、料液比（底物浓度）及水解时间，再采用正交试验分析，选择各因素的参数范围，用L9（34）正交表进行酶解工艺条件的优化。

1.2.1 酶解条件的确定

1）酶解温度：通过预试验确定初步筛选条件，用料液比为（底物浓度）为1∶10的骨素溶液，并分别在温度为 35、40、45、50、55 ℃，加酶量 5000 U/g，pH7 的条件下水解3 h，测定水解度并找出最适的酶解温度。

2）料液比（底物浓度）：通过预试验确定初步筛选条件，根据最适的胰酶酶解温度，分别在料液比（底物浓度）为 1∶2.5、1∶10、1∶7.5、1∶5（g/mL），加酶量为 5000U/g，pH值为7的条件下水解3 h，测定水解度并找出最佳酶解料液比。

3）酶解pH值：通过预试验确定初步筛选条件，根据最适胰酶酶解温度和料液比（底物浓度），分别在pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加酶量 5000 U/g 的条件下水解3 h，测定水解度并找出最佳酶解pH。

4）加酶量：通过预试验确定初步筛选条件，根据最适胰酶酶解温度，料液比（底物浓度）和pH值，并在加酶量分别为 2500、5000、7500、10000 U/g条件下酶解3 h，测定水解度并找出最佳酶解加酶量。

5）酶解时间：选择以上的最佳酶解条件，并在1 h～6 h水解过程中每隔1h测定水解度并找出最佳酶解时间。

1.2.2 水解度（DH）的测定

样品含氮量用凯氏定氮法测定[7]；水解后产生的游离氨基氮用甲醛滴定法测定[8]，测定总氮用凯氏定氮法测定。

式中：DH为蛋白质水解度；N2为酶解后游离氨基氮含量；N1为酶解前游离氨基氮含量；N0为总氮含量。

2 结果与讨论

2.1 酶解温度的确定

用胰酶在选定温度范围对猪骨素进行酶解，酶解后猪骨素的水解度（DH）结果如图1所示，由图1可知，酶解温度对水解度的影响较大，在温度低于45℃时，随着酶解温度的升高水解速度及水解度增加；当温度超过45℃时，水解速率与水解度反而下降。由图1中的温度变化趋势可知，胰酶水解猪骨素的最适温度在45℃左右。

2.2 料液比的确定

料液比对反应速率起着重要的作用。在选定的料液比对骨素酶解3 h，测定最终酶解液的水解度，结果如图2。

如图2所示，随着料液比的增大，水解度不断升高，但是料液比过高时水解度反而下降。结果表明，酶解骨素的最适料液比为 1∶10（g/mL）。

2.3 酶解pH值的确定

在选定的pH值范围内对猪骨素酶解3 h，测定在不同pH值下骨素的水解度，结果如图3。

在pH值小于8时，骨素的水解度随pH的增高而增加，但是在pH值为9时，水解度反而下降，在pH值为8时出现了水解度的峰值。因此，胰酶水解骨素的最适pH值在8左右。

2.4 加酶量的确定

在选定加酶量为 2500、5000、7500、10000 U/g时对猪骨素酶解3 h，测定在不同加酶量下猪骨素的水解度，结果如图4所示。

由图4可知，随着加酶量的增加，骨素的水解度增加，但是当加酶量增加到7500 U/g以上时，骨素的水解度变化趋于平缓，在加酶量为10000 U/g时水解度较2500 U/g时增长幅度为3.3%，加酶量为7500 U/g时水解度较2500 U/g时增长幅度为12.1%，加酶量为5000 U/g时水解度较2500 U/g时增长幅度为3.68%。从经济角度考虑，本试验选用的加酶量为7500 U/g左右。料液比（底物浓度）确定的条件下，水解度的值随着加酶量的增加而加大，但是加入的酶过多，成本增加的同时，酶也可能自溶。

2.5 酶解时间的确定

酶解1 h～6 h后测定胰酶酶解骨素的水解度，结果如图5所示。

由图5可知，随着酶解时间的延长，骨素的水解度不断增加，在2 h～3 h之间，水解度增幅最大。试验中同时发现，酶解时间超过4 h，酶水解液略有苦味。综合考虑以上因素确定胰酶酶解时间为3 h。

2.6 正交试验

通过单因素试验确定了各因素的取值范围，进而用L9（34）正交表对酶解工艺进行优化，试验方案及结果见表1。

表1 胰酶L9（34）正交设计方案及试验结果Table1 The pancreatic enzyme of L9（34）orthogonal design and results

从表1中的R值可以看出，各因素对水解度影响的大小顺序是：C＞A＞B＞D。由表1中的极差可知，最好的酶解工艺组合为C3A2B1D3，即pH值7.5，加酶量8750 U/g，温度 45 ℃，料液比 1∶12.5（g/mL）时酶解效果最好，在此条件下的水解液水解度最高。

3 结论

对影响胰酶水解骨素的关键因素进行了筛选，结果表明，在本试验条件下胰酶水解骨素的最佳工艺条件为：pH7.5，加酶量8750 U/g，温度45℃，料液比1∶12.5（g/mL），水解时间 3 h。在此条件下对骨素进行水解试验的最终水解度为25.00%。酶解后最大限度地保持原有动物新鲜骨肉天然的味道和香气，具有良好的风味增强效果。经酶解后新形成的动物水解蛋白，其用途相当广泛，如用于肉味香精的制造及应用于肉制品中等。

[1]尚一平.骨的营养价值及在灌肠生产中的应用[J].肉类工业,2007(1)：14-15，21

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[8]陈钧辉，陶力，李俊，等.生物化学实验[M].科学出版社，2003：57-58

Enzymolysis Process of Pig Bone Extract by Pancreatic Enzyme

ZHANG Zhi-yu1，ZHANG Jia-min2，WANG Wei2,*，FU Xiao1，GUO Xiu-lan2，LI Xiang2
（1.Biological Engineering Institute，Xihua University，Chengdu 610039,Sichuan,China；2.Sichuan Province Key Laboratory of meat processing，Chengdu University,Chengdu 610106，Sichuan,China）

Pig bone was hydrolysis by pancreatic enzyme and measured the hydrolysis degree of hydrolyzate.Based on single factor（temperature,pH,amount of enzyme,rate of raw material and water,hydrolysis time）experiment,hydrolysis process of pig bone extract by pancreatic enzyme was investigated.Result of orthogonal experiment indicated that the optimal hydrolytic process for pig bone extract was temperature 45℃,pH 7.5,amount of enzyme 8750 U/g,rate of raw material and water 1∶12.5 g/mL,hydrolysis time 3 h and the degree of hydrolysis could reach to 25.00%.

pig bone extract；pancreatic enzyme；hydrolysis；technology

四川省科技厅基础研究基金项目“微胶囊技术在预调现冷保鲜食品中的应用研究”（2008JY0219-1）

张志宇（1983—），男（汉），在读研究生，研究方向：食品加工与贮运保鲜。

*通讯作者：王卫，教授，成都大学肉类加工四川省重点实验室主任，研究方向：食品加工与贮运保鲜。

2009-08-11