祝曙英, 吴 奇， 林成刚, 陈书艳, 史海健

(南京工业大学 化学化工学院,江苏 南京 210009)

生物体发光[1]俗称有生命的光，是化学发光反应中的一种特殊类型，是一种非常高能效的发光体系。萤火虫荧光素(6)存在于萤火虫的发光细胞中，由于其对ATP(三磷酸腺甙)十分敏感，可用于ATP的含量检测[2，3]。天然的6产量极小，无法满足日益增长的需求，通过化学方法合成6显得尤为必要。

在已知的四种合成6的方法中，Seto合成路线[4]由于原料氨甲酰硫代羰基硫代乙酸必须随用随制备，且总收率较低(6.5%)，限制了其应用；White改进路线[5](21%)和Yoshiaki路线[6](34%)总收率相对较高，但合成中用到KCN或CuCN，毒性较大；White早期路线[7，8]起始原料简单易得，但路线较长,总产率仅5.8%。

本文设计了一条更为简短的合成6的新路线。以对甲氧基苯胺(1)为起始原料，经酰胺化、硫代、水解、铁氰化钾氧化等反应构筑了苯并噻唑环得到6-甲氧基苯并噻唑-2-甲酸(2)。首次采用一锅法将对2进行酰氯-酰胺化后，经脱水制得关键中间体2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑(4)； 4经脱甲基、与D-半胱氨酸盐酸水合物反应合成了6(Scheme 1)，总收率20%， 100%ee。其结构经UV，1H NMR， FT-IR和MS表征。

Scheme1

与文献方法相比，该路线具有原料和试剂便宜、易得，工艺更简单、总产率更高、操作更安全等特点，适合逐步放大生产。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

X-4型显微熔点仪(温度计未经校正)；Bruker MD(300 MHz和500 MHz)型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；Nicolet AVATAR-360型红外光谱仪(KBr压片)；双聚焦VG-ZAB-MS型质谱仪(70 eV)。

2参照文献[6]方法合成；其余所用试剂均为分析纯。

1．2 合成

(1) 6-甲氧基-苯并噻唑-2-甲酰胺(3)的合成

在反应瓶中加入250 g(260 mmol),氯仿500 mL, DMF 1 mL和SOCl220 mL(300 mmol),搅拌下回流反应2 h。冷却，于0 ℃滴加氨水50 mL；滴完，继续反应2 h。过滤，滤饼用水洗涤得白色固体3 45 g，收率83%(粗品直接进行下步反应；用重结晶的方法制备少量纯品用于分析)， m.p.252 ℃～255 ℃；1H NMRδ： 8.32(brs, 1H)， 7.94(brs， 1H)， 7.99(d，J=8.85 Hz， 1H)， 7.76(d，J=2.65 Hz， 1H)， 7.21(dd，J=2.65 Hz， 9.1 Hz， 1H)， 3.87(s， 3H); IRν： 3 343， 3 213， 3 176， 3 001， 2 968， 2 935， 2 833， 1 688， 1 659， 1 602， 1 504， 1 402， 1 260， 1 235， 1 117 cm-1。

(2) 2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑(4)的合成

在反应瓶中加入粗品340 g(192 mmol)和POCl380 mL，搅拌下回流反应3 h。冷却至室温，将其缓慢滴加到冰水中，水相用乙酸乙酯(2×100 mL)萃取，合并有机层，依次用饱和NaHCO3溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，粗品用乙酸乙酯重结晶得微黄色固体424 g，收率66%， m.p.120 ℃～122 ℃；1H NMRδ： 8.14(d，J=9.1 Hz， 1H)， 7.86(d，J=2.5 Hz， 1H)， 7.32(dd，J=2.6 Hz， 9.2 Hz， 1H)， 3.88(s， 3H); IRν： 3 445， 3 062， 3 023， 2 980， 2 945， 2 923， 2 842， 2 224， 1 600， 1 506， 1 484， 1 449， 1 271， 1 236， 824 cm-1。

(3) 2-氰基-6-羟基-苯并噻唑(5)的合成

在三口烧瓶内加入吡啶盐酸盐70 g(0.6 mol)，搅拌下于190 ℃加入4 20 g(78 mmol)，体系呈黄色透明熔融态。氮气保护，避光回流反应4 h。冷却，反应物经硅胶柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯100 mL)纯化得黄色固体512 g，收率80%(粗品直接用于下一步反应；取少量粗品用甲醇重结晶得纯品用于分析)，m．p.212 ℃～215 ℃；1H NMRδ： 10.5(s， 1H)， 8.04(d，J=9.0 Hz， 1H)， 7.17(dd，J=9.0 Hz， 2.4 Hz， 1H)， 7.57(d，J=2.4 Hz， 1H)； IRν： 3 428， 3 216， 3 074， 2 228， 1 600， 1 461， 1 438， 1 239 cm-1。

(4) 6的合成

2 结果与讨论

在3的合成中，首次选用CHCl3作溶剂可以较好地稀释反应混合物，使2在回流条件下顺利地与氯化亚砜进行酰氯化反应生成6-甲氧基-苯并噻唑-2-甲酰氯；接着将氨水滴加到反应混合物中,于0 ℃～室温反应2 h即可定量得到3，收率达83%，并直接用于下一步反应。

在4的合成中，由于原料溶解度较差，故不宜使用固体脱水剂(如P2O5)，本文选择POCl3既可作脱水剂，又可以作溶剂。通过TLC监测，回流反应3 h后，3完全转化，收率达66%。

由4合成5的反应采用了吡啶盐酸盐作为去甲基试剂，在190 ℃时，氮气保护，吡啶盐酸和4在熔融状态下反应。脱甲基产物收率80%。

用仿生合成的方法，利用D-半胱氨酸盐酸水合物作为手性底物参与不对称合成，有效的得到手性单一的产物D-(-)-荧光素，ee值达100%。反应在室温，避光，氮气保护，碱性条件下顺利进行，收率89%。

3 结论

设计了一条新的荧光素的合成路线。首次采用一锅法合成了6-甲氧基-苯并噻唑-2-甲酰胺；7步反应总收率20%。

[1] Bur J G, Dekker M. Chemi- and bio-luminesence[J].Methods Enzymol,1978:57-61.

[2] Branchini B R, Southworth T L, Martha H M,etal. A mutagenesis study of the putative luciferin binding site residues of firefly luciferase[J]．Biochemistry,2003,42:10429-10436.

[3] Eriksson J, Karamohamed S. Method for real-time detection of inorganic pyrophos phatase activity.Pal nyren[J].Analytical Biochemistry,2001,293:67-70.

[4] Seto S, Ogura K, Nishiyama Y. A convenient synthetic method of 2-carbamoyl-6-methoxybenzothiazole[J].Bull Chem Soc Jpn,1963,36:331-333.

[5] White E H, Helmut W, George F. Analogs of firefly luciferin[J].J Org Chem,1965,30(7):2344-2348.

[6] Yoshiaki T, Takagi M, Nakata H. A convenient synthetic method of 2-cyano-6-methoxybenzothiazole[J].Bull Chem Soc Jpn,1992,65：392-395.

[7] White E H. The structure and synthesisi of firefly luciferin[J].J Org Chem,1961,83:2402-2403.

[8] White E H, Frank F. The structure and synthesisi of firefly luciferin[J].J Org Chem,1963,85:337-343.