林丽超,陈建红,黄得纯,张济培,司兴奎

(佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山528231)

鸭疫里默氏菌病是侵害雏鸭、雏鹅及雏火鸡等多种禽类的一种急性或慢性败血性传染病,其病变特征为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。本病在我国许多省区均有发生,已成为危害养鸭业最严重的细菌性传染病。目前,药物预防虽有一定效果,但由于细菌耐药性的不断增强,使纯粹依赖药物防治有一定难度;研制安全、有效的疫苗是控制鸭疫里默氏菌病的另一有效途径。本研究拟对雏鸭接种不同佐剂及不同保存时间的鸭疫里默氏菌灭活疫苗,并经攻毒作免疫保护比较,以探讨鸭疫里默氏菌灭活疫苗的有效佐剂及有效保存时间,为提高本病的免疫效果提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株和试验动物 鸭疫里默氏菌菌株来源于广东三水,由佛山科学技术学院畜牧兽医研究所提供。试验动物为1日龄健康仙湖肉鸭,由佛山科学技术学院科研禽场提供。

1.2 疫苗制备 将鸭疫里默氏菌(RA)菌种接种于血液琼脂平板培养基,于37℃烛缸中培养24h,选择单个菌落。将RA纯培养物接种于血清营养肉汤中于37℃恒温增菌培养24h,作RA疫苗基础菌液。加入0.3%甲醛,37℃灭活24h。

每月定期用3种佐剂制备RA灭活疫苗：(1)将RA灭活菌液与一定比例吐温-80混合后制成水相,再与一定比例白油乳化成油乳剂灭活疫苗。(2)将RA灭活菌液按适当比例加入蜂胶提取液(蜂胶10mg/mL),充分混匀成蜂胶灭活疫苗。(3)将RA灭活菌液与铝胶佐剂按一定比例混匀成RA铝胶灭活疫苗[1-2]。

1.3 灭活疫苗安全性试验 灭活疫苗接种于血液琼脂平板培养基,48h后观察,无细菌生长为合格。15只7日龄健康仙湖肉鸭,随机均分3组,1组胸部皮下注射RA油乳剂灭活疫苗2mL/只,2组胸部皮下注射RA蜂胶灭活疫苗2mL/只,3组胸部皮下注射RA铝胶灭活疫苗2mL/只,连续观察10d。

1.4 灭活疫苗保存期试验

1.4.1 保存处理 将先后制备的RA油乳剂灭活疫苗、蜂胶灭活疫苗、铝胶灭活疫苗分别分装,在4℃冰箱保存。抽取保存 90、150、180、210、240、270d的各种灭活疫苗各1瓶进行试验。

1.4.2 动物分组和免疫攻毒试验 将140只1日龄健康鸭随机分成20组,每组7只。1～18组鸭在7日龄按表1经胸部皮下注射不同疫苗作首免(0.4mL/只),14日龄作 2免(0.6mL/只)。19组为非免疫攻毒对照组,20组为健康对照组,不作免疫接种。21日龄对1～19组鸭用同源菌株菌液(菌液活菌数约为1.8×108CFU/mL)通过足垫部注射进行攻毒;注射剂量0.5mL/只。第20组不攻毒作健康对照。攻毒后连续观察10d,统计存活率,并对死亡鸭和存活鸭剖检其病变,对可疑者作细菌分离鉴定。

表1 试验分组与处理

2 结果与分析

2.1 灭活疫苗安全性检验结果 接种3种灭活疫苗后,雏鸭1d内出现精神委顿,食欲下降,1d后精神、食欲恢复正常,试验结束未发现死亡病例,剖检雏鸭无肉眼可见的病变,表明 3种灭活疫苗均具有良好的安全性。但油乳剂灭活疫苗组鸭,注射部位的肌肉可见一绿豆大小的硬块。蜂胶和铝胶灭活疫苗组鸭注射部位未见红肿与异物。

2.2 RA灭活疫苗免疫保护试验结果 从表2可见,油乳剂灭活疫苗随保存时间的延长,免疫保护率保持稳定有逐渐上升的趋势,蜂胶灭活疫苗和铝胶灭活疫苗随保存时间的延长,免疫保护率有逐渐下降的趋势。

同一保存时间不同佐剂疫苗比较,油乳剂灭活疫苗免疫保护率同比均优于蜂胶灭活疫苗和铝胶灭活疫苗。相同佐剂疫苗不同保存时间比较,油乳剂灭活疫苗免疫保护率比较稳定,从90d到270d保存期疫苗免疫保护率维持在71.4%～100%之间,同比优于蜂胶灭活疫苗和铝胶灭活疫苗,保存270d的RA油乳剂灭活疫苗免疫保护率仍可维持在100%。不同保存期的蜂胶灭活疫苗,免疫保护率波动于42.9%～71.4%之间。铝胶灭活疫苗的免疫效果基本与保存时间成反比关系,保存90d的疫苗免疫保护率为71.4%,保存240d的疫苗免疫保护率为33.3%,例外的是保存到270d的疫苗免疫保护率反而有所上升,为57.1%。

表2 3种不同佐剂不同保存时间免疫保护试验结果

2.3 攻毒后剖检结果 对攻毒死亡鸭剖检可见,多数病死鸭发生纤维素性心包炎,心包积液,严重者心包膜与胸腔内膜粘连;肝周炎,表面被裹淡黄色的纤维素性渗出物;其病变特征与鸭疫里默氏菌病典型病变相符。

3 讨论

3.1 不同佐剂RA灭活疫苗免疫效果的比较 油佐剂是目前动物灭活疫苗中应用最为广泛、效果较为可靠的佐剂之一,可刺激机体产生高滴度的抗体。蜂胶内含多种生物活性物质,配合抗原注入机体,可增强补体功能、增强免疫功能细胞及吞噬细胞数量,促进抗体产生,从而增强免疫功能。但蜂胶佐剂的剂型较多,制法不一,并且不同工艺制备的蜂胶佐剂,对免疫作用的影响程度也不一样[3]。铝胶佐剂主要诱导体液免疫应答,不能明显地诱导细胞介导免疫应答。铝胶佐剂在注射部位缓慢释放抗原物质的效应较弱,因而佐剂活性较低,并且对许多抗原的免疫促进作用都不明显。由试验结果可见,RA油乳剂灭活疫苗的免疫保护率效果最好,其次是蜂胶灭活疫苗,最差的是铝胶灭活疫苗。在270d的保存期内6次免疫试验,任何一次油乳剂灭活疫苗的免疫保护率都高于蜂胶灭活疫苗和铝胶灭活疫苗,同比,蜂胶灭活疫苗稍优于铝胶灭活疫苗。这一结果与3种佐剂的基本特性相吻合。

3.2 相同佐剂不同保存时间RA灭活疫苗免疫效果的比较 RA油乳剂灭活疫苗从90d至270d不同保存时间的疫苗免疫保护率在71.4%～100%之间;疫苗保存270d高达100%,表明油乳剂灭活疫苗的有效保存时间最少可达270d;但90d、150d和240d疫苗免疫保护率出现波动,其原因可能由于不同保存期RA油乳剂灭活疫苗制备过程中存在误差,诱导机体产生抗体水平存在差异。蜂胶灭活疫苗免疫保护率基本随着保存时间的增长,表现下降趋势(42.9%～71.4%)。铝胶灭活疫苗免疫效果基本与保存时间成反比关系,下降趋势比蜂胶灭活疫苗更明显(33.3%～71.4%),提示 RA油乳剂灭活疫苗保存稳定性较好,蜂胶灭活疫苗和铝胶灭活疫苗保存稳定性较差。

3.3 免疫注射局部反应 经试验观察,注射油乳剂灭活疫苗组鸭,注射部位的肌肉可见一绿豆大小的硬块,硬块通常随生长增长而消退,蜂胶和铝胶灭活疫苗组鸭注射部位未见红肿。由此可见3种RA灭活疫苗无明显副反应。

3.4 依据3种不同佐剂灭活疫苗免疫保护率的高低及其对雏鸭的副作用大小,建议广大养殖户选用油乳灭活疫苗对鸭疫里默氏菌病进行免疫防治。

[1]姜平.兽医生物制品学[M].北京：中国农业出版社,2003：71-72.

[2]高福,郭玉璞.小鸭传染性浆膜炎疫苗的研究[J].中国兽医杂志,1987,13(6)：51-53.

[3]齐雪峰,杨晓燕,罗薇,等.几种新型佐剂的研究近况及存在问题[J].中国家禽,2003,25(22)：44-45.