梁明珍,靳兴军,沈光年

(北京市兽医实验诊断所,北京朝阳100101)

鸭是禽流感传播链中的一个重要环节,能否有效防控鸭禽流感的关键之一是使用科学的检测方法。目前,是参照禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验标准(GB/T18936-2003)[1],但是,鸭体内含有非特异性抑制因子,血清中的唾液酸残基会模拟红细胞受体,同红细胞受体竞争与流感病毒血凝素的结合,因而会导致非特异性抑制结果(假阳性)的出现,用鸡红细胞悬液检测水禽禽流感血清抗体时,常常存在非特异性凝集现象,出现前带和后带现象,有时能严重影响结果的判定。为此,本文采用不同种家禽的红细胞悬液做重复试验,探讨水禽血清的处理方法及不同种的家禽红细胞悬液对水禽禽流感血清抗体检测的影响,在临床应用中,可为鸭禽流感免疫技术提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF公鸡(梅里亚实验动物中心)红细胞悬液,非免疫鸭红细胞悬液,禽流感H5亚型抗原和标准阴性血清(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所),RDE酶(中国疾病预防控制中心),96孔90度V型血凝反应板,量程为5～50μL单道和八道的精确微量移液器。

1.2 样品采集 采集北京市郊区县蛋、肉用规模化种场、规模化商品场、农村养殖户鸭。

鸭待检血清样品通常选择腿静脉采血,每只采血样2～3mL,经2500r/min离心或自然放置析出血清。

1.3 试剂 配制 pH7.0～7.2、0.01mol/LPBS作为稀释液;阿氏液(Alsevers)作为红细胞保存液;1%和5%的鸡 、鸭红细胞悬液。

1.4 方法 采用禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验(按GB/T18936-2003标准)[1],《高致病性禽流感和口蹄疫等主要动物疫病免疫方案》(农医发[2008]5号),家禽免疫后21d进行免疫效果监测。存栏禽群免疫抗体合格率必须≥70%判定合格。禽流感抗体血凝抑制试验(HI)抗体效价≥4log2为免疫合格,群体免疫抗体合格率必须≥70%判定合格。

2 鸭禽流感免疫抗体HI的判定标准和比较试验

2.1 方法比较 方法1：鸭血清样本经5%鸡红细胞悬液处理。血清吸附处理方法：在V型血凝反应板第1列孔中先加采集的鸭血清样本50μL,然后再加5%鸡红细胞悬液50μL,振荡混匀,室温作用1h后作为待检鸭血清样本,按国标进行凝集抑制实验。

方法 2：将待检鸭血清样本经受体破坏酶(RDE)处理。RDE吸附处理方法：将待检鸭血清与受体破坏酶按1∶4混合,经 37℃水浴过夜,次日56℃灭活50min后,作为待检鸭血清样本,按国标进行凝集抑制试验。

方法3：将未经任何处理的待检鸭血清样本,按国标进行凝集抑制试验,但分别用鸡或鸭红细胞悬液做对比改良试验。

2.2 试验结果 见表1、表2。

从表1和表2可以看出,经5%鸡红细胞吸附处理的待检鸭血清(加上处理时的稀释度)比未经5%鸡红细胞吸附处理后的待检鸭血清HI效价平均值高0.55;未经DEF处理的待检鸭血清比经DEF处理后的待检鸭血清HI效价(加上处理时的稀释度)平均值高0.10;加入1%鸭红细胞悬液比加入1%鸡红细胞悬液的试验HI效价平均值高0.8。经DEF处理后的待检鸭血清及加入1%鸭红细胞悬液的HI试验无非特异性凝集出现。所有试验标准阴性血清对照成立。

3 鸭禽流感免疫抗体HI方法的应用

将重组禽流感灭活疫苗(H5N1亚型)进行免疫,用HI方法,按表3进行抗体监测。

免后21d进行监测抗体,HI抗体平均水平小于或者等于4log2时,须加强免疫,以后每个月监测抗体1次。通过对283个场户,种鸭60只,肉鸭223只,1667份样本监测,免疫次数与免疫抗体效价如图1,呈明显正相关。

3.1 种鸭(蛋鸭) 分析10个区县免疫合格率大于70%的场户的免疫,发现首免时机集中在3～10日龄,2免时机集中在20～30d后,以后间隔免疫的时间平均为3个月,接种疫苗3次时有70%的场户合格率达到70%,接种疫苗4次后有85%的场户合格率达到70%,接种疫苗6次后,98%的场户达到70%的合格率。

表1 3种方法凝集抑制试验

表2 HI效价及非特异性凝集比较

表3 禽流感灭活疫苗免疫

图1 免疫抗体监测图

3.2 肉鸭 分析10个区县的15个场户,发现首免日龄集中在3～7日龄,约50%的场户在20日龄前后做了加强免疫。虽然抗体合格率不能达到70%,但通过野毒检测,没有感染情况出现。此外,根据实验室的试验,雏鸭的母源抗体一般可维持10～15d。

3.3 小鸭机体对免疫无可见的免疫应答,其原因可能是受母源抗体的影响或与小鸭免疫系统尚未成熟有关,由此启示在鸭禽流感免疫中2周龄的小鸭尤其是生长期短的肉鸭,不能依赖主动免疫而应加强种鸭免疫来提高母源抗体水平,使其建立良好的天然被动免疫。

3.4 从临床观察鸭经禽流感疫苗免疫后无论抗体水平高低,带毒检测都为阴性,这种现象提示鸭经禽流感疫苗免疫可降低甚至避免鸭群禽流感的带毒现象。

4 讨论

4.1 试验结果表明,方法1可降低水禽血清中非特异性凝集因子对检测的影响,但吸附不完全,方法繁杂,耗时长,不适合大批检测;方法2可完全去除鸭血清中的非特异性凝集因子,但处理血清的成本高,对大批量检测过程繁杂,在临床中不易广泛使用;方法3中用鸡红细胞悬液检测鸭血清抗体有非特异性凝集现象,且出现前带或后带现象,干扰结果判定,抗体滴度均值比鸭红细胞悬液检测鸭血清抗体均值要低0.8个滴度。方法3中用鸭红细胞来检测鸭的禽流感血清抗体,几乎可完全消除非特异性凝集因子对鸭禽流感抗体检测的影响,与占松鹤[2]、吴俊华[3]、张评浒[4]等文章的研究结果一致,更能准确客观的反映抗体水平,适合在不增加检测成本的基础上大批检测,笔者认为该方法较好。

4.2 目前,控制鸭禽流感的主要手段是借鉴鸡的免疫程序形成的免疫监测体系。特禽、水禽等禽类接种流感疫苗免疫效力的评价还缺乏足够的血清学依据。是否用同源红细胞来检测禽流感疫苗免疫效力评价方面有待于更多的工作和监测数据予以支持。

4.3 北京市在2005年开始进行对水禽的全面禽流感免疫,我们从免疫抗体主动监测的上千份样本数据中发现,鸭场按照其规程免疫过的鸭群中,免疫保护率如果按鸡的保护率标准计算,同种类的疫苗在鸡的保护率则高达90%以上,而鸭的抗体保护率则低于鸡的保护率。

4.4 鸡的禽流感免疫监测体系不完全适合于鸭,经过连续免疫抗体监测试验及带毒筛查,证明H5N1亚型禽流感新型疫苗对水禽免疫有可靠效果,虽然鸭等水禽初次接种疫苗后保护率偏低,但多次免疫后免疫应答良好,可避免感染和降低病毒的侵害,鸭禽流感抗体血凝方法检测的应用为鸭禽流感防控提供了有价值的数据依托。

[1]GB/T18936-2003,高致病性禽流感诊断技术[S].

[2]占松鹤,刘华.不同家禽红细胞悬液检测水禽禽流感抗体对比试验[J].畜牧与饲料科学,2009,30(5)：11-12.

[3]吴俊华,邱艳红,叶玮,等.用鸭红细胞悬液消除非特异性凝集因子对鸭禽流感 HI试验的影响[J].养禽与禽病防治,2006(12)：5-6.

[4]张评浒,唐应华,仇旭升,等.不同家禽红细胞悬液对禽流感血清抗体检测的影响[J].中国兽医科技,2005,35(4)：267-271.