刘文倩 张建刚 谢岚 艾华

北京大学第三医院运动医学研究所（北京100191）

肥胖的发生发展主要是能量代谢失衡，摄入的能量超过消耗，多余的能量以脂肪的形式在体内累积的一个过程。增肥容易减肥难，减肥之难在于减肥的顽固艰涩，在于人们在生理和心理上对减肥的抗拒。Ghrelin是近年来新发现的、对肥胖的发生发展起着重要调节作用的细胞因子[1]，主要由胃组织分泌，下丘脑、垂体、肾脏等处也有少量分泌。给大鼠长时间注射外源性ghrelin后，其摄食量、食物利用率、体重和脂肪含量明显增加，能量消耗和脂肪利用率显著降低[2]，因此认为ghrelin可能参与了肥胖发生的病理生理机制，亦有可能参与减肥的抵抗。本研究通过对营养性肥胖大鼠进行运动和限食减肥，观察其体内ghrelin的变化，初步探讨ghrelin在减肥过程中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 肥胖大鼠建模

雄性断乳 SD大鼠 100只，体重 44.0±4.0g，由北京大学医学部实验动物中心提供。大鼠随机分为2组，对照组20只，建模组80只。

1.1.1 饲料组成

普通饲料:碳水化合物50%，蛋白质20%，脂肪4%，能量3.16kcal/g，由北京科澳协力公司生产。高脂饲料:碳水化合物30.9%，蛋白质15.8%，脂肪41.2%，能量5.58kcal/g。

1.1.2 喂养方法

SPF级环境下单笼饲养，饲养温度 22±1℃，湿度40%～60%，12h明暗循环，动物自由摄食和饮水。对照组大鼠喂食普通饲料，建模组大鼠采用普通饲料和高脂饲料混合喂养的方法[3]进行饲喂。

1.1.3 肥胖大鼠建模情况

建模组大鼠经混合喂养20周后，以对照组Lee’s指数[体重（g）1/3×1000/体长（cm）]的正常值上限 +tv，a·s为肥胖确定标准，大于此标准为肥胖大鼠。

1.2 实验动物分组

将32只肥胖大鼠随机分为4组:肥胖对照组、游泳减肥组、限食减肥组和游泳+限食减肥组，每组8只。随机抽出普通饲料喂养的大鼠8只作为正常对照组。肥胖对照组继续混和喂养。游泳减肥组每天上午8点到12点之间，游泳40分钟，每周游泳6天，持续5周，游泳水温28～30℃。限食减肥组计算减肥开始前2周动物平均每日进食量减量1/3，喂养3周后，再减量 1/3，并再持续2周。游泳+限食减肥组游泳条件与单纯游泳减肥组一致，限食条件与限食减肥组一致。正常对照组继续普通饲料喂养。正常对照组、肥胖对照组和游泳减肥组大鼠自由进食。各组自由饮水。实验前后称量各组大鼠体重。

1.3 标本采集和保存

禁食12小时后，将大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，经腹主动脉取血，迅速将血转入EDTA-K抗凝并添加抑肽酶（aprotinin，25KIU/μl，待测血浆 ghrelin）的离心管，混匀后室温离心分离血浆（3000r/min，20min），分装后液氮速冻，然后转入-80℃冻存。取血后速取出胃组织，沿胃大弯切开，清除内容物，用PBS冲洗干净，用铝箔纸包好，迅速投入液氮中速冻，之后转入-80℃冰箱保存。然后按照同样的方法取出内脏脂肪并称重。

1.4 指标测定

血浆ghrelin水平采用美国Phoenix Pharmaceuticals公司的ELISA试剂盒测定。胃组织ghrelin水平采用美国Phoenix Pharmaceuticals公司的RIA试剂盒测定。ghrelin mRNA表达水平采用实时定量RT-PCR方法检测。RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒购自TIAN GEN BIOTECH 公司，SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）购自Takara公司。Ghrelin的引物序列为Forward:5’-GTC TTC AGC GAC TAT CTG C-3’，Re verse:5’-GTG GCT TCT TGG ATT CCT-3’，128bp；内参 18S 序列:Forward:5’-GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3’，Reverse:5’-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3’，147bp。预变性 95℃ 30s，PCR 反应 95℃ 10s，60℃30s，40 个循环。

1.5 统计学分析

统计分析使用11.5版SPSS统计软件完成。所有数据以平均数±标准差（±s）表示。减肥前后各组体重的比较采用配对样本t检验分析；多组间比较采用One-Way ANOVA的方法；当资料服从双变量正态分布时选择Pearson方法计算相关系数，当不服从双变量正态分布时选择Spearman方法。显著性水平为P<0.05，非常显著性水平为P<0.01。

2 结果

2.1 体重

5周减肥后，与减肥前自身体重相比，各减肥组体重均明显下降（P<0.05），游泳减肥组、限食减肥组和游泳+限食减肥组分别下降了1.67%、4.41%和5.74%。若综合考虑肥胖对照组大鼠体重增加的百分比（14.75%），则实际上3个减肥组大鼠的体重则分别相当于减少16.42%、19.16%和 20.49%，见表1。

表1 减肥前后各组大鼠体重比较（n=8）

2.2 内脏脂肪重量

5周减肥后，与肥胖对照组相比，各减肥组大鼠肾周脂肪和睾周脂肪均明显降低（P<0.01），3个减肥组之间无明显差异（表2）。

表2 各组大鼠内脏脂肪重量比较（g）（n=8）

2.3 血浆和胃组织ghrelin表达

肥胖对照组大鼠血浆ghrelin水平较正常对照组降低，但无统计学意义（P>0.05）。与肥胖对照组相比，游泳减肥组和游泳+限食减肥组血浆ghrelin显著升高（P<0.05），而限食减肥组仅有升高趋势（P>0.05），具体见图1A。

肥胖对照组胃组织ghrelin蛋白表达水平较正常对照组显著降低（P<0.05）。与肥胖对照组相比，游泳减肥组和游泳+限食减肥组胃组织ghrelin显著增加（P<0.05），但限食减肥组无明显变化（P>0.05），如图1B。

肥胖对照组胃组织ghrelin mRNA表达水平较正常对照组显著降低（P<0.05）。与肥胖对照组相比，各减肥组胃组织ghrelin mRNA表达均明显增强（P<0.05），见图1C。

2.4 Ghrelin表达水平与体重、内脏脂肪量之间的关系

机体ghrelin水平与体重和内脏脂肪量都呈负相关关系，即随着体重和内脏脂肪量增加，ghrelin表达量呈减少的趋势。其中，胃组织ghrelin mRNA表达与体重和内脏脂肪量之间存在显著相关关系（P<0.05）。内脏脂肪中的睾周脂肪与ghrelin水平关系较为密切，与胃组织ghrelin蛋白和mRNA表达呈显著负相关（P<0.05）。其它相关性未见统计学意义（P>0.05）。

表3 Ghrelin表达与体重、内脏脂肪重量的相关关系（以相关系数r表示）

3 讨论

Ghrelin是由28个氨基酸残基组成的多肽，是体内促生长激素分泌素受体的内源性配体，它具有强烈的刺激生长激素分泌的作用[4]。此外，ghrelin还可以刺激摄食，促进脂肪合成，减少脂肪动员利用，促进脂肪细胞增殖和分化，进而导致体重增加，其调节脂肪代谢不依赖生长激素而独立进行[5]。

研究表明，内源性ghrelin水平会随着体重的变化而出现波动。我们曾经观察到，具有肥胖倾向的大鼠（肥胖发展的早期），胃组织ghrelin呈高表达[6]。动物和人体实验都发现，肥胖发生后，由于体脂能量积累过多，ghrelin合成降低，以减少进食和能量储备。当肥胖个体体重减轻后，虽然还没有减到正常体重，下降的ghrelin就已经出现回升[7]。本实验结果显示，肥胖大鼠胃组织ghrelin蛋白和基因表达显著降低（P<0.05），血浆ghrelin呈下降趋势（P>0.05）；运动、限食及运动+限食减肥后，除了限食减肥组大鼠胃ghrelin蛋白表达未出现增加外，其余胃组织ghrelin mRNA和蛋白表达以及血浆ghrelin浓度均出现明显增加或增加趋势（图1）。

有关运动对血ghrelin水平影响的研究结果多有矛盾。以往研究观察到一次性或短时间运动可以导致血浆ghrelin 浓度升高[8]、降低[9]或没有变化[10]。血 ghrelin 的这种变化可能与一次性运动对体重一般产生较小影响有关。长时期运动对血ghrelin的影响也有不同的报道。有研究显示，正常体重Wistar大鼠进行5周中等强度运动后，体重下降，脂肪组织减少，血浆ghrelin浓度降低[11]。Foster-Schubert等报告，绝经后的肥胖女性，在不限制能量摄入的情况下进行1年适度有氧运动锻炼，那些最终体重下降的受试者血ghrelin明显升高，而体重没有变化者则无明显变化[12]。这个实验结果似乎表明，运动本身对血浆ghrelin的持续浓度没有影响，只是体重变化才使其发生改变。本实验中，肥胖大鼠经过5周的游泳减肥后，体重下降，内脏脂肪含量减少，血浆ghrelin浓度显著升高，胃组织ghrelin蛋白和基因表达也明显增强，与Foster-Schubert等的研究结果一致。

通过限食或能量限制减轻体重，也可引起机体ghrelin水平的升高。Beck等[13]发现肥胖Zuke大鼠限食后，体重下降10%，血浆ghrelin水平明显升高。Heinonen等[14]的研究也得到了同样结果:受试者每天摄入800kcal，持续8周，体重下降≥5%，空腹ghrelin水平明显升高。让7～9岁的肥胖儿童限制食物摄入1年，发现体重指数（BMI）在前6个月显著降低，但在接下来的6个月中开始回升。血浆ghrelin浓度在前6个月持续上升，在6月达到峰值，然后开始下降，在12月时差不多回到初始水平[15]。本实验中，肥胖大鼠限制食物摄入 5周，体重下降，内脏脂肪含量降低，血浆ghrelin呈升高趋势，胃组织ghrelin基因表达显著增强。

运动联合限食可明显引起体重下降，引起血ghrelin升高。Santosa等[16]让35～60岁肥胖女性减少能量摄入20%，参加运动增加能量消耗10%，导致30%的能量负平衡，6 个月后发现，体重下降了 11.7±2.5kg（P<0.0001），血ghrelin升高了21.2±26.7%（P<0.001）。北卡罗来纳的最近一项研究也表明，肥胖个体限制能量摄入并参加运动锻炼6个月，体重和脂肪含量都明显降低，血浆ghrelin水平显著升高[17]。本研究限制肥胖大鼠食物摄入，并令其进行游泳训练，5周后，体重和脂肪含量显著降低，血浆ghrelin、胃组织ghrelin蛋白及基因水平都明显升高。但也有不同的结果。有人对肥胖儿童青少年的研究发现，经过10天的限食和运动后，BMI显著降低，血浆ghrelin有上升趋势但无统计学意义[18]。Morpurgo 等[19]的研究也显示，经过3周限食和运动减肥，体重明显下降，但空腹ghrelin水平无明显变化。导致血浆ghrelin变化不明显的原因可能与实验时间短有关。

目前大部分研究认为，ghrelin与BMI、体重和脂肪含量呈负相关[20]。最近 Sondergaard 等[21]也报告，ghrelin与BMI和总的脂肪含量呈负相关关系，其中内脏脂肪与ghrelin的关系尤为密切。本实验结果也显示，ghrelin与体重和内脏脂肪含量呈负相关，其中睾周脂肪与ghrelin的相关程度较高。

胃脏是体内合成分泌ghrelin的主要组织，其产生的ghrelin分泌入血，是血液ghrelin的主要来源。本研究显示，体重下降引起的血浆ghrelin升高或升高趋势伴随着胃组织ghrelin蛋白和mRNA表达的升高或升高趋势，而后者的升高决定了前者的升高。胃组织ghrelin表达的上调可能与减重时出现的胃排空和饥饿感有关。减肥过程中，体重的减轻伴随着能量负平衡和饥饿感，这引起ghrelin回升。增高的ghrelin可增强食欲刺激，促进脂肪合成，给继续减肥带来障碍。Ghrelin在减肥中的作用值得注意，机体对减肥的抵抗可能与ghrelin分泌增加有关。遏制ghrelin的升高，可能有助于消除减肥抵抗。

4 总结

饮食诱导的肥胖大鼠血浆和胃组织ghrelin水平下降，经过运动和限食导致体重减轻后，体内ghrelin的表达和分泌水平呈现回升。体内ghrelin水平与体重呈负相关。血浆ghrelin水平回升与胃组织ghrelin表达增高有关。减肥过程中，伴随着体重下降而出现的ghrelin水平回升，可能是机体减肥抵抗的生理性因素之一。

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