夏岩石夏延斌蒋立文

（1 湖南科技学院 生命科学与化学工程系，永州 425006; 2 湖南农业大学 食品科技学院，长沙 410128）

0. 言

豆豉是中国传统民间豆制品之一。大豆经微生物作用后不仅保留了大豆中原有营养成分，而且除去了大豆中不利人体的溶血素和胰蛋白酶抑制剂等有害物质，同时产生一定量大豆多肽、大豆异黄酮、核黄素和维生素B12等活性成分，经酶解后的营养成分易于人体吸收，并且味道鲜美，深受人们的喜欢[1,2]。利用纯毛霉接种制曲生产豆豉，因培养时间较短，成品中的氨基态氮的含量不高，货架后期产品易出现老化品质变硬问题，影响口感。本实验拟通过前发酵条件的优化，提高豆豉前发酵过程中蛋白酶的形成，有助后发酵过程大豆蛋白的充分分解，提高产品氨基态氮含量，降低产品硬度。

1.料与方法

1.1.料与仪器

1.1.1.辅材料

大豆、邵阳大曲酒、生姜、麸皮和土豆全部市售。

毛霉菌：由湖南农业大学微生物教研室提供。

1.1.2.要药品与试剂

葡萄糖、干酪素、L-酪氨酸、盐酸、磷酸、硼砂、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、亚硫酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠、碘、碘化钾、可溶性淀粉、硫酸铜、硫酸钾、甲醛等均为分析纯。

1.1.3.要试验仪器

722S型分光光度计、SHZ-82 气浴恒温振荡器、YXQ.SG46.280型高压蒸汽消毒器、250B型恒温生化培养箱、S-3C型pH精密计、LD4-2A式医用离心机、SW-CJ-IB标准型净化工作台。

1.2.验方法

1.2.1.种的制备

菌种的活化：将斜面菌种在无菌操作台接种到PDA斜面培养基上，放在25～28℃恒温培养箱中培养48～72h，放在冰箱中保存备用[3]。

生产菌种制备：在300m1三角瓶中加入15g麸皮，按麸皮与水的质量比1：1.1，混合均匀，三角瓶口塞棉塞并包扎防潮纸，于0.1MPa灭菌40min，取出摇动，冷却到28～30℃，在无菌条件下进行接种，平置于25～28℃温箱内，培养24h后扣瓶1次再培养，等瓶内麸皮长满菌丝及灰色孢子后取出备用[2]。

1.2.2.发酵温度对豆豉毛坯产蛋白酶的影响

大豆蒸熟冷却至室温，按3%的接种量接种优质毛霉麸曲，分别置于10℃，15℃，20℃，25℃，28℃，35℃条件培养48h后测定毛坯的蛋白酶活力，以确定适宜的前发酵温度。

1.2.3.发酵时间对豆豉毛坯产蛋白酶的影响

大豆蒸熟冷却至室温，按3%的接种量接种优质毛霉麸曲，置于25℃条件下培养，24h后开始测定毛坯的蛋白酶活力，每隔6h测定一次，以确定适宜的前发酵时间。

1.2.4.H值对前发酵产蛋白酶的影响

用pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8等不同溶液制成孢子悬浮液进行接种，置25℃条件进行培养，期间用相应的pH溶液进行喷洒，维持培养期间的相对湿度，48h后测毛坯的蛋白酶活力，确定前发酵条件的适宜pH值。

1.2.5.aCl浓度对前发酵产蛋白酶的影响

用0M，0.2M，0.4M，0.6M，0.8M，1.0M等不同浓度的NaCl溶液制成孢子悬浮液进行接种，置25℃条件进行培养，期间用相应的NaCl溶液进行喷洒，维持持培养间的湿度，48h后测毛坯的蛋白酶活力，探讨NaCl溶液对前发酵产蛋白酶的影响。

1.2.6.源酶处理对前发酵产蛋白酶的影响

采用30℃水浸泡大豆至衡重，滤干置30℃条件下发芽6h激活内源酶，然后在45℃利用大豆内源酶分别酶解大豆2h，4h，6h。处理后，熟化大豆进行接种，25℃，培养48h后测豆豉毛坯的蛋白酶活力。

1.2.7.豉前发酵条件正交优化试验

表1.豉前发酵条件的试验因素和水平

大豆于25℃浸泡至增重1～1.2倍，选择内源酶作用温度、内源酶作用时间、前发酵时间和NaCl浓度为试验因素，设置三个水平，进行L9(43)的正交试验，各因素水平列于表1。豆豉前发酵后添加适当食盐、生姜和白酒，37℃后发酵7d，最后测定产品的氨基态氮、还原糖的含量和产品的硬度。进一步确定前发酵条件用对豆豉产品品质的影响，对各因素指标进行综合分析，从而优化豆豉的前发酵条件。

1.3.测项目及方法

1.3.1.白酶活力的测定

1.3.1.1.酶液的制备 取一定量的豆豉毛坯，加入250毫升0.3M食盐溶液，经高速组织捣碎搅匀后于25℃抽提1h，取清滤液适当稀释后进行蛋白酶活力的测定。

1.3.1.2.活力的测定方法 采用福林试剂法[4]测定中性蛋白酶。酶活力定义为，在40℃，一定pH条件下1分钟水解干酪素产生1μg酪氨酸所需的酶量为一个蛋白酶活力单位。

1.3.2.化指标的测定

氨基态氮的测定：采用甲醛法[5]。

还原糖的测定：采用3,5—二硝基水杨酸法(DNS法)[5]。

豆豉硬度的测定：采用精度0.5g药物天平改装成简易硬度测定仪，天平的一端放水杯，另一端放样品，样品上方固定一个直径3mm的长钉，在测定时以一定的流速添加水于水杯中，样品所受压力逐渐增大，直到豆豉断裂。以豆豉的断裂力(N)来判断豆豉的硬度，每一批样取10个样品测量,取平均值[6]。

2.果与分析

2.1.发酵温度对豆豉毛坯产蛋白酶的影响

根据实验方法1.2.2，前发酵不同温度条件下豆豉毛坯的蛋白酶活力为图1。

图1.发酵温度对毛坯产蛋白酶的影响

图2.发酵对毛坯产蛋白酶的影响

从图1可知随着培养温度的升高，豆豉毛坯的蛋白酶活力也增加，在28℃条件下蛋白酶活达到最大，但温度达35℃时，毛坯的蛋白酶活急剧下降。相关研究表明毛霉生长的温度范围内随温度的升高，菌体生长加快，但温度达35℃时，毛霉菌生长受到抑制。菌体生长的优劣直接影响产酶量，豆豉前发酵的温度选择25～28℃有利于毛坯中蛋白酶的积累。由于豆豉前发酵是一个开放的过程，28℃培养易感染杂菌，影响成品的品质，因此选择25℃进行前发酵比较适合。

2.2.发酵时间对豆豉毛坯产蛋白酶的影响

根据实验方法1.2.3，前发酵不同时间豆豉毛坯的蛋白酶活力为图2。由图2可知，25℃条件下，随培养时间的延长，豆豉毛坯的蛋白酶活力也增加，在48h，蛋白酶活达到最大。40～50h范围内，毛坯的蛋白酶活力比较稳定，都有利于后发酵游离氨基酸的形成。随着时间的延长，蛋白酶活有明显的下降，可能是由于毛霉老化的原因。因此，豆豉前发酵制曲时间应控制在40～50h，才有利于蛋白酶的积累和后发酵蛋白质的分解。

2.3.H值对前发酵产蛋白酶的影响

根据实验方法1.2.4，前发酵不同pH值条件豆豉毛坯的蛋白酶活力为图3。由图3可知，在pH5～6的范围内，有利于豆豉毛坯积累蛋白酶，pH值过高或过低都会影响蛋白酶的产生。

图3.H值对前发酵产蛋白酶的影响

图4.aCl浓度对前发酵产蛋白酶的影响

2.4.aCl对前发酵产蛋白酶的影响

根据实验方法1.2.5，前发酵不同NaCl浓度条件豆豉毛坯的蛋白酶活力为图4。从图4可知随着NaCl溶液浓度的增加，豆豉毛坯的蛋白酶活力也相应的提高。当浓度达到0.6M时，蛋白酶活力最大，随着NaCl溶液浓度的进一步增加，蛋白酶活力急剧下降。可能的原因是NaCl能在水中产生电离而成为激活剂，促进了毛霉菌株蛋白酶的合成代谢，并且可以使结合态的蛋白酶从菌丝体上游离出来，但NaCl浓度过高时，毛霉生长受到明显的抑制，从而引起酶活的下降。

2.5.芽处理对前发酵产蛋白酶的影响

根据实验方法1.2.6， 不同发芽处理后，豆豉前发酵毛坯蛋白酶活力结果见表2。

表2.源酶处理对豆豉前发酵的影响

由表2可知，内源酶处理能提高豆豉毛坯的蛋白酶活力,45℃处理6h毛坯的蛋白酶活力达到最大值。黄豆发芽过程中，由于分解酶和合成酶的作用，同时进行分解和和合成的代谢，当分解代谢占优势时，能提高熟化大豆内的游离氨基酸、可溶性总糖及活性微量元素的含量，这有利于毛霉的生长和产蛋白酶；而当合成代谢占优势时，游离活性成分的减少，毛霉的生长和产酶可能受到影响。鉴于生产周期和成本的考虑，45℃处理2h是最佳选择。

2.6.豉前发酵条件的正交试验

选择前发酵时间（A）、NaCl浓度（B）、内源酶作用温度（C）和内源酶作用时间（D）为试验因素，设置三个水平，采用L9（43）正交表进行正交试验，试验结果列于表4。从表4的试验结果可看出，豆豉前发酵不同条件对豆豉后发酵产品的氨基态含量、还原糖的含量及产品的硬度都有明显的影响，其中内源酶作用温度对豆豉产品三个指标的极差值影响最大的，而其它因素的影响对不同的指标有差异，其原因可能是适宜的内源作用温度最利于大豆物质的分解，形成小分子物质，进一步促进了豆豉后发酵过程中毛霉酶系对物质的分解，从而增加了产品氨基态氮的含量，降低了产品的硬度。影响产品各指标的因素主次顺序见表5所示。

表4.发酵正交试验L9（43）的结果

K10.4450.4460.4190.433 K20.4420.4400.4420.446 K30.4460.4470.4720.454Σ=4还原糖的含量（%）R0.0040.0070.0530.021优水平A3B3C3D3 K11.111.010.841.03 K20.971.001.070.97 K30.880.931.030.94Σ=8.85产品的硬度（N）R0.230.080.230.09优水平A3B3C1D3表5 各指标的极差分析试验指标主次顺序氨基态氮的含量（%）CABD还原糖的含量（%）CDBA产品的硬度（N）CABD

以产品的氨基态氮的含量和产品的硬度为指标分析时，各因素的影响是一致的，且产品的鲜味和质地对风味的影响大，而产品还原糖的含量仅对风味有一定的调和作用，不是主要影响因素，故选择豆豉前发酵最佳条件为：A3B3C1D3，即前发酵时间55h ，NaCl浓度0.6M，内源酶作用温度为40℃，时间为2.5 h。

3. 论

综上所述，影响豆豉前发酵的因素有多个，较为适宜的前发酵条件为温度25℃，pH5～6之间，NaCl浓度0.6M，前发酵时间在55h，大豆经过发芽内源酶处理也有利于豆豉毛坯的蛋白酶积累和氨基态氮的提高，适宜的作用条件为浸泡大豆30℃发芽处理6h，40℃酶解2.5h。提高豆豉前发酵蛋白酶的活力，有利于豆豉后发酵期蛋白质的分解，改善了成品的品质和风味。

[1]邬玉香,夏延斌,刘爱玲.大豆异黄酮在豆豉生产中的稳定性[J].湖南农业大学学报,2002（3）:237-238.

[2]蒋立文,周传云,邬玉香.传统美食豆豉工业化生产的研究[J].食品科学,2003(3):59-64.

[3]钱存柔,黄仪秀. 微生物学实验教程[M].北京:北京大学出版社,2000.

[4]姜锡瑞.酶制剂应用手册[M].北京:中国轻工业出版社,2001.

[5]王瑞芝,杜晓湘.中国腐乳酿造[M].北京:中国轻工业出版社,1998.

[6]李远志,郑素霞, 罗树灿等.真空微波加工马铃薯脆片的工艺特性[J].食品与发酵工业,2003,29(8):40-43.