张启云，李冰涛，徐国良，孙立波，汤喜兰，黄丽萍，余日跃，刘红宁

(1.江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌 330006;2.江西中医学院药学院，江西南昌 330006)

代谢组学(metabonomics)是后基因时代出现的一门新的组学学科，主要是通过核磁共振，质谱联用定量检测生物液如尿液，血液和胆汁等中相对分子质量小于1000的内源性物质，结合化学计量学的方法对获取的多维数据进行处理和分析，提取有用的数据信息，判定生物标志物，再通过进一步研究解释药物作用的机制［1］。代谢组学研究思路上的整体性和动态性，与中医药理论的整体观念是相一致的［2］，因此，将代谢组学的方法应用到中医药研究中，有助于从整体上完整地了解中医药的作用机制。

干姜是一种基本的热性中药，目前尚未有文献记载干姜对正常大鼠尿样中内源性代谢产物的影响。本文利用液相色谱-质谱联用的检测平台开展对中药材干姜水提物对SD大鼠尿液的代谢组学研究，并利用主成分分析(principal component analysis，PCA)，正交信号校正和偏最小二乘法判别分析(orthogonal signal correction-partial least square discriminate analysis，OSC-PLS-DA)化学计量学方法分析干姜的代谢组学特征，以期发现可作为生物标志物的内源性物质。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

SD大鼠，雄性，体重220～240 g，江西中医学院动物中心提供，许可证号:SCXK(赣)2006-0001，大鼠自由摄食饮水，温度:21～25℃，日照时间12 h。干姜，产地四川犍为，家种统装，产品批号:20061003。干姜水提液提取的具体方法:400 g干姜切片，加10倍量水浸泡1 h，微沸回流提取1.5 h，过滤收集提取液;再相当于原药材重量的8倍量水提取1 h，合并2次水提液，旋转蒸发浓缩干姜水提液至6 kg·L－1(每升水提液相当于6 kg干姜生药材)。SIGMA3-18K低温高速离心机(Sartorius公司，德国)，Agilent1200 6410三重四极杆质谱仪(Agilent公司，美国)，电子分析天平(Sartorius公司，德国)，甲酸(Fluka公司，美国)，乙腈(Tedia公司，美国)，水为去离子水，数据处理软件为SIMCA-P11.0(Umetrics AB公司，瑞典)，SQL Server(Microsoft公司，美国)，SPSS13.0(SPSS公司，美国)。

1.2 动物分组处理

20只大鼠随机分为正常对照组和干姜组，每组10只，干姜组大鼠每天14:00 ig给予干姜生药0.72g·kg－1，每天 1 次，连续 30 d，正常对照组按 10 ml·kg－1给予蒸馏水。

1.3 尿液收集及样品制备

正常对照组和干姜组大鼠分别于第0，1，8，15，22，29天收集14:00给药后3 h内尿液，－20℃保存。低温解冻，4℃下15 493×g，离心5 min，取上清液0.5 ml加入甲醇 0.5 ml，混匀，在 4℃下静置3 h，29 703 ×g离心10 min，取上清液，进样。

1.4 高效液相色谱-质谱-质谱法测定尿液中内源性物质

1.4.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax Eclipse SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相:乙腈(A)、0.1%甲酸(B)流速:0.4 ml·min－1，进样量:3 μl，柱温:35℃，运行20 min。梯度洗脱条件如下:0～6 min(B:100%)，6～ 8 min(B:30%)，12～14 min(B:10%)，14.1～15 min(B:10%)，后运行5 min。

1.4.2 质谱条件

离子源模式:ESI正离子模式;毛细管电压:4000V;雾化器压力:275.8 kPa;干燥气流速:10 L·min－1，干燥气温度:350℃，全扫描监测得尿液总离子流色谱图(total ion chromatogram，TIC)，提取质谱信息，得到尿液样品所含物质的质荷比(mass-tocharge，m/z)。

1.5 数据集及生物标志物判定

使用SIMCA-P 12.0自带程序进行正交信号校正(OSC)，正交信号校正过程中，类别变量为Y变量。数据经Pareto标准化后，进行OSC-PLS-DA分析［3］。对OSC-PLS-DA模型中变量重要程度(variable importance，VIP)＞3的变量进行独立样本t检验，VIP是反映变量对模型重要性的系数，VIP值越大，变量对模型越重要。生物标志物是能够代表外来刺激和内源性生理改变的内源性物质，反映在OSC-PLS-DA模型上即是具有显著差异的重要变量。在95%的置信度下变量内正常对照组与干姜组数据具有显著差异的变量为生物标志物［4］。

1.6 统计学分析

应用SIMCA-P 12.0多变量分析软件进行统计学分析。组间比较采样用独立t检验，两两比较采用SPSS13.0软件和Hotelling T2检验。

2 结果

2.1 干姜对大鼠尿液中内源性物质代谢影响的时间轨迹分析

将液相色谱-质谱法扫描得大鼠尿液TIC(图1)中获取的正常对照组和干姜组大鼠尿液样品所含物质的丰度信息将数据转化Excel数据表。对给药后第0，1，8，15，22和29天正常对照组和干姜组大鼠尿液中内源性物质的丰度值均值做PCA分析。通过均值样本点距离，以分析干姜对内源性物质代谢影响的时间轨迹，进而比较各采样时间点干姜对大鼠尿样内源性物质的影响。时间轨迹分析过程，数据标准化使用Pareto，结果如图2。

图2结果表明随着给药时间的不同，正常对照组和干姜组各时间点的得分值都发生了变化，说明时间因素可能对大鼠内源性物质有影响;其次，比较各时间点的正常对照组与干姜组的差异，给药第8天正常对照组与干姜组尿样均值样本点间距离较其余时间点中两组样本点间距离大，表明第8天干姜对大鼠内源性物质代谢的影响比其他时间点大，因此，使用第8天数据分析干姜对大鼠尿样代谢产物的影响。

图1 液相色谱-质谱法大鼠尿液的总离子流色谱图.Fig.1 The total ion chromatogram of the rats.

图2 时间对大鼠ig给予干姜后尿液中内源性物质的影响的主成分分析图.干姜组大鼠每天14:00 ig给予干姜0.72 g·kg－1，正常对照组大鼠给予蒸馏水，连续30 d，收集给药3 h后尿样，液相色谱-质谱法采集尿样中内源性物质的质荷比和丰度值，数据匹配后，对采样时间点按组别分类的均值作主成分分析，主成分的分散点图反映原始数据整体分布特征，以观察干姜对内源性物质代谢影响的时间轨迹.△:正常对照组;▲:干姜组，0，1，8，15，22，29表示尿样取样时间点.Fig.2 Principal component analysis(PCA)of data about effect of time on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizoma Zingiberis.

2.2 给药第8天干姜对大鼠尿液内源性物质影响的主成分分析

对给药第8天正常对照组与干姜组尿样中内源性物质丰度值主成分分析，得分图见图3，正常对照组与干姜组样本点各自具有良好的聚类特征，两组之间没有样本点重合，说明在给药第8天干姜对大鼠尿液中内源性物质的代谢的影响。

图3 干姜对大鼠ig给予干姜第8天尿液内源性物质影响的主成分得分图.动物分组给药见图2.△:正常对照组;▲:干姜组.Fig.3 PCA score plot of data about effect of Rhizoma Zingiberis on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizoma Zingiberis at d 8.

2.3 给药第8天干姜对大鼠尿液内源性物质影响的OSC-PLS-DA分析

除干姜因素外，大鼠的个体差异，饮食，昼夜变化等都会影响大鼠尿样中内源性物质的代谢，将严重影响分析结果的正确性。正交信号校正(OSC)是一种基于偏最小二乘法的滤噪方法，能够消除与Y(分类变量)变量正交成分(饮食等外界因素的数据信息)，保留有效的数据信息，提高模型的有效性和解释能力。

使用SIMCA-P 11.0自带的程序所得正交信号对本实验进行校正，校正过程中以组别变量为Y变量，删除前两个与Y变量正交成分。正交信号校正前删除差异样本点8rz3。正交信号校正后建OSCPLS-DA 模型。模型的 R2X=0.721，R2Y=0.999，Q2=0.971，即拟合后的模型能解释72.1%X变量，99.9%Y变量。Q2=0.971，表明经7倍交叉有效性检验模型有效。图4和图5分别为OSC-PLS-DA模型的得分图及相应的载荷图。与图3相比较，图4中正常对照组与干姜组样本有更好的分离趋势，且组内差异变小，表明OSC-PLS-DA比PCA具有更好的分类能力。正常对照组和干姜组样本点在得分图中沿第一主成分分开。第一主成分主要包含干姜水提液对大鼠尿样代谢产物影响的数据信息，因此应提取第一主成分VIP变量。图5显示多数变量在原点附近，少数变量偏离原点，对模型有重要影响，所代表的物质为可能的生物标志物。

图4 干姜对大鼠ig给予干姜后第8天尿液内源性物质影响的OSC-PLS-DA分析得分图.动物分组给药见图2.△正常对照组;▲干姜组.Fig.4 OSC-PLS-DA score plot about effect of Rhizoma Zingiberis on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizome Zingiberis at d 8.

图5 干姜对大鼠ig给予干姜第8天尿液内源性物质影响的OSC-PLS-DA分析的载荷图.动物分组给药见图2.▲:以质荷比命名的变量，□内为可能生物标志物变量.Fig.5 Loading plots of OSC-PLS-DA about effect of Rhizoma Zingiberis on endogenous metabolites after rats were ig given Rhizoma Zingiberis at d 8.

2.4 可能受干姜影响的大鼠尿液内生物标志物

采用液相色谱-质谱联用筛查内源性物质信息，依据内源性物质数据对OSC-PLS-DA模型的影响和生物标志物的统计学特征筛查生物标志物。由于干姜具有成分复杂、药理作用广泛的特点，提取一种物质来表示干姜对大鼠内源性物质的影响，难以全面描述干姜对大鼠内源性物质的影响作用。因此将VIP值大于3.0，独立样本T检验(95%)正常对照组和干姜组数据具有显著性差异的变量定义为生物标志物变量。通过查找相关网站HMDB/KEGG/METLIN，初步确定可能生物标志物如表1。

表1 干姜影响大鼠尿液内源性物质的可能生物标志物Tab.1 Possible biomarkers in endogenous metabolites affected by Rhizoma Zingiberis after Rhizoma Zingiberis was ig given in rats for 30 d

3 讨论

干姜为姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的干燥根茎，又名白姜、均姜。中医的理论认为干姜为热性中药，具有温中散寒、回阳救逆、燥湿消痰的功用［5］。临床用来治疗肠炎，腹泻，呕吐，冠心病，心肌梗死等疾病。现代药理研究表明，干姜具有镇痛抗炎，保肝利胆，抗溃疡，改善心血管系统等药理活性［6］。本研究结合代谢组学的方法，研究了干姜水提物的灌胃大鼠尿液代谢组特征，初步筛选10种生物标志物来标记干姜水提物对大鼠内源性物质的影响。其中，磷脂酸具有刺激血小板聚集，平滑肌收缩，体内血管活性等生物活性。孕烯醇酮硫酸盐属肾上腺皮质激素类物质。这两种物质的变化与热性中药在心血管中的药理作用和温热中药对内分泌系统的影响具有一定的相关性［7－8］。神经酰胺-1-磷酸能够通过易位和激活细胞质磷脂酶A2而诱导花生四烯酸和前列腺素的合成［9］。花生四烯酸和前列腺素是炎症的主要介质，文献报道干姜是通过降低细胞质磷脂酶A2的活性而发挥抗炎作用的［15］。因此，可以推断干姜抗炎作用的传导细胞信号可能是神经酰胺-1-磷酸。

本研究结果表明，干姜在大鼠尿液中生物标志物的变化与干姜药理、药性的研究成果一致，为热性中药药性理论研究提供了实验依据。

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