沈 洪，亓志刚，谢梅林

(1.湖州师范学院医学院药理学教研室，浙江湖州 313000;2.苏州大学医学部药理学系，江苏苏州 215123)

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一种非酒精性脂肪性肝病［1-2］，其发病机制尚不完全清楚。目前较公认的“二次打击”学说认为，胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是第一次打击，可导致肝脏对多种损伤因素的敏感性增加;第二次打击如氧化应激和炎性细胞因子等损伤因子可导致脂肪变的肝脏发生炎症、坏死和随后的纤维化［3］。近年越来越多的研究资料显示，过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome peroliferator-activated receptor，PPAR)在脂肪性肝炎的发生发展和转归过程中发挥了重要的作用［4-5］，故目前在临床上常将PPARα激动剂和(或)PPARγ激动剂用于脂肪性肝炎的治疗，但治疗效果不尽相同，而且有些PPARα激动剂和PPARγ激动剂具有明显的不良反应。从理论上推测，应用PPARα/γ双重激动剂的治疗效果应更好，因为两者可产生协同的抗炎作用。

阿司匹林为一种传统的解热、镇痛和抗炎药物，可通过抑制环氧合酶(cyclooxygenase，COX)的活性减少前列腺素(prostaglandin，PG)的合成来发挥治疗作用。近年来有文献报道，阿司匹林可以通过激活 PPARα/γ 发挥其药理学活性［6］，而且阿司匹林可以影响大鼠肝脏和肾脏中PPARα/γ相关靶基因的表达［7］，提示阿司匹林可能是 PPARα/γ 双重激动剂，但未见阿司匹林用于脂肪性肝炎治疗的研究报道。本研究制备高脂高糖诱发的大鼠脂肪性肝炎模型，观察阿司匹林对脂肪性肝炎的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物

SD大鼠，雄性，清洁级，体重为220～240 g，由苏州大学实验动物中心提供，动物生产许可证号:SCXK(苏):2007-0010;动物使用许可证号:SYXK(苏):2007-0035。大鼠饲养于温度为19～23℃，相对湿度为50% ～70%的屏蔽区内，自由饮水进食。实验前大鼠适应环境3 d。动物实验依照苏州大学实验动物应用及管理条例规定进行。

1.2 药物、试剂和仪器

阿司匹林，白色粉末，购自美国Sigma公司，批号:105K0131。临用时用蒸馏水配成0.5%的浓度。总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)测定试剂盒购自浙江伊利康生物技术有限公司，批号均为090903。血清谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase，GPT)和空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号均为20081222。大鼠基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)ELISA测定试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，批号:0911271。

722型分光光度计，由上海第三分析仪器厂生产;80-2型台式离心机，由上海医疗器械有限公司手术器械厂生产;TCL-10G型高速台式离心机，由上海安亭科学仪器厂生产;FJ-200型高速分散均质机，由上海金达生化仪器有限公司生产;MR23i台式冷冻离心机，由法国Jouan公司生产;AL104电子天平，由梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司生产。

1.3 脂肪性肝炎模型的制备及分组

大鼠分为正常对照组和高脂高糖造模组。造模组大鼠于每天上午9:00 ig给予高脂高糖乳剂(由10%胆固醇，40%玉米油，15%蔗糖，2%蛋白质，1%胆盐，3.1%丙二醇，3.6%吐温-80 等组成［8］)10 ml·kg-1，每天1次，正常对照组给予等体积蒸馏水。6周后处死3只大鼠观察肝脏脂肪变性及炎症程度，评价造模情况。将造模成功后的大鼠分为模型组和阿司匹林10 mg·kg-1组，每组10只，均再继续ig给予脂肪乳3周;同时阿司匹林组每天14:00 ig给予阿司匹林。第4周，两组动物停用脂肪乳，模型组继续ig给予等体积蒸馏水，阿司匹林组继续给予阿司匹林。

1.4 血清TC，TG，FBG和GPT水平的检测

1.3分组处理大鼠末次给药后所有大鼠禁食不禁水12 h，用4%水合氯醛麻醉后腹主动脉取血，胆固醇氧化酶-PAP法测定血清TC，磷酸甘油氧化酶-PAP法测定TG，比色法测定FBG和GPT。

1.5 肝重系数测定及肝组织病理学检查

取肝脏称重，肝重系数以每100 g体重肝脏所占的重量(g)计算表示。取大鼠肝脏组织，用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后HE染色［9］，在光镜下观察肝组织的炎症程度:-，无;+，平均10个高倍视野见炎症细胞浸润灶≤5个;++，平均10个高倍视野见炎症细胞浸润灶＞5个但＜10个;+++，平均10个高倍视野见炎症细胞浸润灶≥10个。

1.6 肝组织中TC，TG和MMP-9含量的检测

每鼠称取肝组织1 g，加三氯甲烷∶甲醇(1∶1，V/V)混合液至5 ml后匀浆，匀浆液置4℃ 24 h后离心，取上清10μl置另一试管中，室温放置12 h以上，待三氯甲烷和甲醇挥发后，分别采用胆固醇氧化酶-PAP法和磷酸甘油氧化酶-PAP法测定肝组织匀浆的TC和TG含量。另取500 mg肝组织加冰生理盐水制成10%匀浆，离心取上清，按ELISA试剂盒双抗体夹心法测定MMP-9。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 阿司匹林对脂肪性肝炎模型大鼠总胆固醇，甘油三酯，空腹血糖水平和谷丙转氨酶活性的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠血清TC，TG，FBG水平和GPT活性均显著升高(P＜0.01或P＜0.05);阿司匹林治疗4周后，血清TG，FBG水平和GPT活性较模型组均明显降低(P＜0.01或P＜0.05)，但对血清TC水平无明显改善作用(表1)。

2.2 阿司匹林对脂肪性肝炎大鼠肝重系数及肝组织结构的影响

与正常对照组的肝重系数2.39±0.14相比，模型组肝重系数明显升高(3.83±0.60，P ＜0.01);阿司匹林对肝重系数无改善作用(3.93±0.15)。HE染色结果显示，正常对照组大鼠的肝脏结构正常，未见有脂肪变性和炎症细胞浸润;模型组大鼠肝组织可见有脂肪变性、较多的炎性细胞浸润及中心周围坏死;阿司匹林治疗4周后，大鼠肝组织中的炎性细胞明显减少，但脂肪变性程度未见有明显减轻(表2和图1)。

表1 阿司匹林对脂肪性肝炎模型大鼠血清TC，TG，空腹血糖(FBG)和谷丙转氨酶(GPT)水平的影响Tab.1 Effects of aspirin on the serum TC，TG，fasting blood glucose(FBG)and glutamic pyruvic transaminase(GPT)levels in steatohepatitis rats

表2 阿司匹林对脂肪性肝炎模型大鼠肝组织病理变化的影响Tab.2 Effect of aspirin on the hepatic histopathological changes in steatohepatitis rats

图1 阿司匹林对脂肪性肝炎模型大鼠肝组织病理变化的影响(HE ×100).动物处理见表1.A:正常对照组;B:模型组，可见有大小不等的脂质空泡和较多的炎性细胞浸润(箭头所示);C:阿司匹林组，浸润的炎症细胞明显减少，但脂质空泡未见有明显减少(箭头所示).Fig.1 Effects of aspirin on the hepatic histopathological changes in steatohepatitis rats(HE ×100).

2.3 阿司匹林对脂肪性肝炎模型大鼠肝组织中总胆固醇，甘油三酯和基质金属蛋白酶9含量的影响

与正常对照组相比较，模型组大鼠肝脏组织中的MMP-9含量明显升高(P＜0.05)，TC和TG含量也显著增加(P＜0.01)。阿司匹林治疗4周后，与模型组比较，可见大鼠肝组织中的MMP-9含量显著降低(P＜0.01)，肝组织中TC和TG的含量虽有一定的降低，但无统计学差异(表3)。

表3 阿司匹林对脂肪性肝炎模型大鼠肝组织中基质金属蛋白酶9(MMP-9)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平的影响Tab.3 Effects of aspirin on the matrix metalloproteinase-9(MMP-9)，total cholesterol(TC)and triglycerides(TG)contents in steatohepatitis rats

3 讨论

本研究结果表明，高脂高糖诱导的脂肪性肝炎模型大鼠，其肝组织中可见有较多的炎症细胞浸润，并伴有局灶性坏死和血中GPT水平的升高。用阿司匹林治疗后，肝组织中炎性细胞的浸润明显减少，血中GPT的水平也恢复至正常水平，提示阿司匹林对脂肪性肝炎具有一定的治疗作用，这为阿司匹林新的临床应用提供了药理学依据。

阿司匹林是一种传统的抗炎药，通过抑制COX活性来减少PG的合成。近年来有文献报道，阿司匹林可以通过激活PPARα/γ来发挥其药理学活性［6］，可以抑制肿瘤细胞和人冠状上皮细胞中MMP-9的表达［10-11］。阿司匹林也可以通过激活PPARα/γ和抑制COX-2/前列腺素E合酶(prostaglandin Esynthase，PGES)-1途径来减少人和小鼠腹腔巨噬细胞表达和释放MMP-9［12-14］。本研究发现，阿司匹林可以减少脂肪性肝炎大鼠肝组织中MMP-9含量。由此推测，阿司匹林可能也是通过PPARα/γ和COX-2/PGES-1通路来抑制MMP-9的表达，而且这两条通路可能是部分重叠而相互影响的。

MMP-9是MMP的一种，可导致胶原的分解，并与人类动脉粥样斑块破裂及急性缺血性心脑血管事件存在密切的联系。MMP-9在大鼠肝脏主要由Kupffer细胞和星状细胞产生，参与基底膜Ⅳ型胶原的代谢，降解正常肝窦基底膜，破坏肝脏细胞生存的微环境。本研究结果表明，脂肪性肝炎模型组大鼠肝组织中的MMP-9含量明显较正常对照组升高，阿司匹林治疗后MMP-9含量明显降低，提示阿司匹林可能通过抑制肝脏MMP-9的产生，减少肝组织中胶原的降解，使血液中的炎症细胞不易进入肝脏组织，从而发挥抗炎作用;但另一方面，MMP-9的降低有可能加速脂肪性肝炎向脂肪性肝纤维化的发展。因此，MMP-9在脂肪性肝病不同阶段的病理学意义值得进一步探讨。

已有文献报道，阿司匹林可降低糖尿病代谢综合征患者的血糖和血浆胰岛素水平，改善IR［15］，也能降低IR大鼠的血浆胰岛素水平，增加胰岛素敏感性［16］。本研究结果表明，阿司匹林可以降低脂肪性肝炎大鼠血中的FBG水平，也提示阿司匹林可能有改善IR的作用。因为NASH的发生和发展与肝脏中脂质蓄积造成的IR有关，脂质的蓄积可造成过氧化及炎症因子的分泌，炎性因子又可加强IR，阿司匹林可通过激活PPARα/γ抑制NF-κB而减少炎症细胞因子的释放［12］，从而改善IR。

综上所述，阿司匹林虽不能改善脂肪性肝炎的肝脏脂肪变性，但可明显改善脂肪性肝炎的炎症状态，对脂肪性肝炎可能具有一定的治疗作用。

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