虞 淼,吴淑春

(1.浙江省农产品质量监督检验测试中心,浙江杭州 310020; 2.浙江医学高等专科学校,浙江杭州 310053)

食品中性激素多组分残留分析方法的概述

虞 淼1,吴淑春2

(1.浙江省农产品质量监督检验测试中心,浙江杭州 310020; 2.浙江医学高等专科学校,浙江杭州 310053)

综述了最近报道的关于应用色谱法检测食品中性激素多组分残留的分析方法。首先对性激素作简短的介绍,然后着重概述了性激素多组分残留的分析方法,包括样品的提取、纯化和各种不同的检测方法,并对各种不同的分析方法进行详细阐述。最后总结了性激素多组分残留检测方法的发展趋势。

性激素,多组分残留,分析方法

2 性激素多组分残留检测方法

在一定范围内,性激素作为兽药使用在法律上是允许的,但作为动物的生长促进物质是被严格禁止的。近年来,人们又把目光投向了食品中性激素的残留情况,包括各种肉制品,动物内脏,乳制品等。因此,就需要有不断发展的关于性激素多组分残留的检测方法。同时由于食品中性激素的痕量残留(ng～μg·kg-1)和食品基质本身的复杂性,这就要求这些检测方法不但要具有很高的灵敏度,并且要具有相应合适的性激素残留的提取和纯化方法。

从报道的文献来看,主要还是集中在肉制品中性激素多组分残留的分析检测,并出现了一系列关于肉制品中性激素多组分残留检测的方法[4-8,10]。但是对于肾脏、肝脏和乳制品[11]中的性激素多组分残留检测方法的报道较少。

2.1 样品的提取和纯化

由于食品样品基质的复杂性和性激素的痕量残留 (ng～μg·kg-1),以及样品提取和纯化过程的复杂性,导致很多相应的检测方法最后的回收率较低,这样也使得食品中性激素多组分残留的检测变得很具有挑战性。

一般来说,固体样品(如肾脏、肝脏)先经粉碎或冷冻干燥或均质化后,再经有机溶剂提取,然后应用各种方法进行一系列的纯化,如液液萃取 (LLE)、固相萃取(SPE)等。根据文献报道,固相萃取是性激素纯化过程中最常用的手段[6,8,10,12]。另外,也有报道其他的新方法如超临界流体萃取 (SFE)在性激素提取纯化过程中的应用[13,17]。

目前很多关于性激素残留检测方法都是针对食品中游离态性激素的。对于结合态的性激素,一般在样品的处理过程中先使用 Helix pomatia液(含有β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶)[5,7-8,10]等酶解液对样品进行水解,不过由于动物组织中结合态性激素可以被酶解的部分含量很低,因此使用 Helix pomatia液对样品进行水解的有效性还存在很大的争议。Har tmann和Steinhart[15]对使用酶解液进行酶解过程中性激素结构变化的可能性进行了讨论,如孕烯醇酮转变成孕酮。

最近的研究表明,动物组织中性激素的提取一般都使用甲醇作为提取剂[4,6,8],然而,Fuh[12]和Blasco[10]等指出使用乙腈作为提取剂能得到更纯的提取物。Daeseleire[5]等在提取过程中则使用二乙醚作为提取剂。

对一个分析方法来说,粗提物的纯化很关键,因为它直接关系到最后目标物质的检测。从表 1中可以看出,SPE过程用到的吸附剂一般是 C8、Si-NH2、C18,通过使用这些特定的吸附剂,可以把不同性质的性激素一一分离[8,16]。

2.2 几种先进的提取和纯化技术

前面 2.1中提到的方法通常比较耗时、费力,同时需要大量的有机试剂,并且这些方法只能针对同一类或几小类性激素的分析,因此,在这里介绍几种可能用到的新的提取纯化技术。

表1 GC-MS检测样品中性激素多组分残留的方法

加速溶剂萃取 (ASE),也叫加压液体萃取(PLE),它是一种在高温高压下对固体样品提取的技术,该方法在环境化学和食品分析中应用较广泛。这个方法最大的优点就是能减少试剂的用量和加快提取过程。虽然这是一项很有前途的技术,但在性激素多组分残留分析过程中很少应用,几乎未见有相关的文献报道。

超临界流体萃取(SFE),跟索氏提取法类似的一项技术,区别是提取过程中使用超临界流体作为溶剂,最常用的超临界流体是二氧化碳[13,17]。这项技术的最主要优点是高扩散率、低粘度和较小的表面张力。但关于在性激素残留检测过程中使用该技术的报道很少,就本人掌握的文献有：Din[18]等使用该技术提取牛肉中的群勃龙;Huopalahti和 Henion[19]应用该技术对牛组织中七种雌激素进行提取。值得一提的是,该项技术目前还主要针对环境化学领域,而不是食品中痕量性激素残留的分析。

固相微萃取(SP ME),该项技术的原理是利用被分析组分在样品基质与提取剂中的分配不同,从而达到分离目的[17]。Ridgway[20]等提到,和溶剂提取相比,SP ME具有能减少溶剂的使用、同步完成提取、净化和浓缩过程以及在样品量很小的情况下也能处理等优势。然而,到目前为止很少有关于该项技术应用于动物源固体食品中性激素提取的报道。

微波辅助提取 (MAE),它利用提取过程中对固体样品的搅动和加热从而提高提取的效率。由于它能缩短提取时间和减少试剂用量,因此比索氏提取更具有优势。这项技术在环境样品中应用很广泛,比如从环境样品中提取性激素、除草剂、苯酚、多环芳烃和多氯联苯[21],但是还没有关于该项技术应用于食品中性激素提取的报道。Her mo等[22]利用该项技术对猪肉中的喹诺酮残留进行了提取。

2.3 性激素的检测方法

过去的几年中,主要是利用色谱 (GC或 LC)联用高灵敏度的检测系统,比如MS,对食品中性激素多组分残留进行检测,其中,又以 GC-MS或 GC-MS -MS(气相色谱-质谱-质谱)应用最广泛。然而,近年来,LC-MS(液相色谱-质谱)在性激素多组分残留检测中的应用越来越广泛。这些色谱技术已经慢慢取代了原来的免疫法和薄层色谱法。

在过去,对于一些性激素的检测主要是利用放射免疫法(R IA)和酶联免疫法 (EL ISA)。如今,由于这些方法本身的局限性,如低灵敏度、不能满足质量控制标准的要求,应用已经越来越少了。而 GC和LC由于它们的高灵敏度、高特异性,已经慢慢取代了上述方法。只有在一些特定物质的检测上,如α-或β-群勃龙,依旧会用到高效薄层色谱(HPT LC)。

根据文献报道,对于食品中性激素多组分残留的分离和检测最常用的技术就是气相色谱串联一级或多级质谱[MS(-MS)]。但是由于性激素本身的热不稳定性和不易挥发性,因此在用气相色谱检测时,需要对性激素进行衍生化。从文献中可以发现,对于性激素的衍生化,主要是利用各种不同衍生化试剂或衍生化试剂结合一系列催化剂对性激素分子结构中的羟基和/或酮基进行衍生化。几乎所有的文献中都提到了利用MSTFA(N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺)作为硅烷化衍生试剂,另外MSTFA+NH4I或MSTFA+T MSI或MSTFA+T M IS+DTE作为衍生化试剂同样具有很好的效果[6,23-24],其中 NH4I、T MSI、T M IS等是作为催化剂的。Seo等[9]使用MSTFA+二硫赤藓糖醇(DTE)+NH4I作为混合衍生试剂,这里DTE作为抗氧化剂。

如今,高效液相色谱串联各种高灵敏度的检测系统在性激素多组分残留的分析中应用越来越广泛,它具有高选择性、高灵敏度和高特异性,最重要的是使用该技术,样品不需经衍生化。此外,由于缺乏一种能对各种性激素都有效的普遍使用的衍生化试剂,也促进了各种基于液相色谱检测性激素方法的发展,然而,各种检测性激素残留的 LC-MS方法都是针对环境样品[25]或尿样[26]的,相比与 GC-MS,应用 LC-MS检测动物源食品中性激素残留的很少[10,14,27],主要应用在检测群勃龙类 (热不稳定性)和康力龙(气相色谱对其结构中的吡唑环具有强吸收)等性激素。另外,LC串联各种MS(如离子阱或飞行时间质谱仪)技术使得分析检测新的未知性激素成为可能,这些技术有望在未来几年内更多地应用到食品中性激素多组分残留的检测中去。

3 结论

如今,由于生产方面的需要,更多的牲畜养殖户会在养殖生产过程中多多少少使用一些合法的或违禁的药物来促进牲畜的生长,而一些食品生产厂家为了获取更多的经济利益,也会在生产加工过程中添加一些添加剂,在这些药物和添加剂当中也包括了各种性激素。由于好多药物和添加剂的使用是受国家或国际上的相关法律法规严格控制的,因此有关方面也出台了很多关于食品中性激素多组分残留的检测方法。

总体来说,在食品中性激素多组分残留的检测中,固相萃取以及 GC-MS应用最广泛,然而,如今更多的焦点转到了使用 LC-MS进行分析检测。除此之外,更多尖端的提取纯化技术和检测技术也不断发展起来,如超临界流体萃取技术、飞行时间质谱仪等。而另外一些技术,如加速溶剂萃取、选择性吸附剂等,由于新的性激素不断出现,并且相关的设备很昂贵,则在性激素残留分析中的使用受到越来越多的限制。

目前我国的食品安全状况不容乐观,最近的毒奶粉事件也反映出了我国在一些检测技术和检测标准上的滞后。而如今食品中性激素残留的情况很普遍,虽然国家出台了各种政策法规来遏制性激素进入饲养业而对人体造成危害,但各种违禁药物还是屡禁不止。这主要是我国的标准体系不够健全,而且现有的标准测定目标单一,检测效率低下,检测成本较大;另外我国的畜牧业生产大多数是以家庭饲养为主,饲养农户大多数使用自己配制的饲料进行喂养,添加违禁药物的行为很隐蔽,难以从饲料源头进行控制。因此,探索一些高效快速的性激素多残留检测方法对食品安全质量控制、检测效率的提高,以及检测成本的降低具有重要的实际意义,同时对改善我国食品安全的状况具有重要意义。

[1]StubbingsG W, Cooper AD, Shepherd MJ, etal. Determination of 19-nortestosterone and trenbolone in animal tissues by high-perfor mance liquid chromatography with immunoaffinity clean-up[J].Food Addit Contam,1998,15(3)：293-301.

[2]Sadao Nakamura,Tan Hwee Sian,Shigeki Daishima. Determination of estrogens in riverwater by gas chromatographynegative-ion chemical-ionization mass spectrometry[J].J ChromatogrA,2001,919：275-282.

[3]崔晓亮,邵兵,赵榕,等 .超高效液相色谱-串联电喷雾四极杆质谱法同时测定牛奶中 12种糖皮质激素的残留[J].色谱,2006,24(3)：213-217.

[4]Hartmann S,H Steinhart.Simultaneous determination of anabolic and catabolic steroid hormones in meatby gas chromatography-mass spectrometry[J].ChromatogrBiomedAppl, 1998,704：105-117.

[5]Daeseleire E,Vandeputte R,Van Peteghem C.Validation of multi-residue methods for the detection of anabolic steroids by GC-MS in muscle tissues and urine samples from cattle[J]. Analyst,1998,123(12)：2595-2598.

[6] Impens S,De Wasch K,Cornelis M,et al.Analysis on residues of estrogens,gestagens and androgens in kidney fat and meatwith gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].J ChromatogrA,2002,970：235-247.

[7]湛嘉,李佐卿,俞雪钧,等 .猪肉中 16种性激素的多残留检测方法[J].宁波大学学报：理工版,2007,20(4)：520-525.

[8]Marchand P,B Le Bizec,C Gade,et al.Ultra trace detection of a wide range of anabolic steroids in meat by gas chromatography coupled to mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2000,867：219-233.

[9]Seo J,H Kim,B C Chung,et al.Simultaneous determination of anabolic steroids and synthetic hormones in meat by freezinglipid filtration,solid-phase extraction and gas chromatographymass spectrometry[J].J ChromatogrA,2005：1067：303.

[10]Blasco C,C Van Poucke,C Van Peteghem.Analysis of meat samples for anabolic steroids residues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]J Chromatogr A, 2007,1154：230.

[11]Malekinejad H,P Scherpenisse,A A Bergwerf.Naturally occurring estrogens in processed milk and in raw milk(from gestated cows)[J].J Agric Food Chem,2006,54：9785.

[12]FuhM,S Huang,TLin.Determination of residual anabolic steroidsin meatby gas chromatography ion- trap mass spectrometer[J].Talanta,2004,64：408-411.

[13]StolkerA A M,PW Zoontjes,L A van Ginkel.The use of SFE for the Determination of Steroids in Animal Tissues[J].The Analyst,1998,123：2671-2676.

[14]Hooijerink H,vanBennekom EO,NielenM W F.Screening for gestagens in kidney fat using accelerated solvent extraction and liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry [J].Anal Chim Acta,2003,483(1-2)：51-59.

[15]Har tmann S,H Steinhart.S imultaneous determination of anabolic and catabolic steroid hor mones in meatby gas chromatography-mass spectrometry[J].Arch Lebensmittelhyg, 1997,48：111.

[16]Hartmann S,M Lacorn,H Steinhart.Natural occurrence of steroid hormones in food[J].Food Chem,1998,62：7-20.

[17]Kureckova K,B Maralikova,K Venture.Supercritical fluid extraction of steroids from biological samples and first experience with solid-phase microextraction-liquid chromatography[J].J ChromatogrB,2002,770：83.

[18]Din N,KD Bartle,A A Clifford,et al.Supercritical Fluid Extraction of Sulphamethazine and its Metabolites from meat tissues[J].J High Resol Chromatogr,1994,19：465.

[19]Huopalahti R P,J D Henion.The use of supercritical fluid extraction for the determination of steroids in cattle tissues[J].J Liquid Chromatogr Relat Technol,1996,19：69.

[20]Ridgway K,S P D Lalljie,R M Smith.Sample preparation techniques for the determination of trace residues and contaminants in foods[J].J ChromatogrA,2007,1153(1)：36.

[21]Liu R,J L Zhou,A W ilding.Microwave-assisted extraction followed by gas chromatography-mass spectrometry for the determination of endocrine disrupting chemicals in river sediments [J].J ChromatogrA,2004,1038：19.

[22]Hermo M P,D Barrón,J Barbosa.Determination of residues of quinolones in pig muscle Comparative study of classical and microwave extraction techniques[J].Anal Chim Acta,2005,539：77.

[23]陈捷,秦燕,张美金 .气相色谱-质谱法检测动物肌肉组织中残留的甾类同化激素[J].色谱,2006,24(1)：19-22.

[24]Maume D,B Le Bizec,PMarchand,et al.N-methyl-N-alkylsilyltrifluoroacetamide-I2 as a new derivatization reagent for anabolic steroid control[J].Analyst,1998,123(12)：2645.

[25]BarontiC,R Curini,GD’Ascenzo,et al.Monitoring natural and synthetic estrogens at activated sludge sewage treatment plants and in a receiving riverwater[J].Environ Sci Tech,2000, 34：5059-5065.

[26]Van Poucke C,M Van De Velde,C Van Peteghem. Combination of liquid chromatography-tandem mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry for the detection of 21 anabolic steroid residues in bovine urine[J].J Mass Spectrom, 2005,40(6)：731.

[27]StolkerA A M,PW Zoontjes,P L W J Schwillens,et al. Determination of acetyl gestagenic steroids in kidney fat by automated supercritical fluid extraction and liquid chromatography ion-trap mass spectrometry[J].Analyst,2002,127：748-754.

Review of residualmulti-component analyticalmethods for the determination of steroid hormones in foods

YUM iao1,W U Shu-chun2
(1.Zhejiang Provincial Centre of Supervision and Testing ofQuality ofAgricultural Products,Hangzhou 310020,China; 2.ZhejiangMedical College,Hangzhou 310053,China)

This p ap e r reviewed recently p ub lished m ulti-res idue chrom a tog rap hic m e thods for the de te rm ina tion of s te roid horm ones in food.Afte r a b rief introduc tion on s te roid horm ones,an ove rview emp has ized on m ulti-res idue ana lytica lm e thods w ith de ta il exp lica tion,cove ring samp le extrac tion and p urifica tion as we ll as chrom a tog rap hic sep a ra tion and d iffe rent de tec tion m e thods,be ing in use for the de te rm ina tion of s te roid horm ones.Fina lly,the deve lopm ent trends of m ulti-res idue de tec tion m e thods for the de te rm ina tion of s te roid horm ones we re summ a rized.

s te roid horm ones;m ulti-res idue;ana lytica lm e thods

TS207.3

A

1002-0306(2010)02-0378-04

1 概述

性激素是一类由动物体性腺所产生或人工合成的低分子量、亲脂性、具有生物活性的类固醇类物质,根据其生物活性和药理作用,可以将其分为重要的两类：性类固醇和皮质类固醇。前者又包括雌激素、孕激素和雄激素。另外目前还有很多人工合成的性激素,临床应用较多的如己烯雌酚。

从20世纪50年代起,性激素这一大类物质就被用于动物的喂养,如今欧盟已经对其在动物喂养方面的使用进行了严格禁止。同时关于性激素对人体的危害也引起了公众的广泛关注,有报道称,近年来妇女子宫瘤、乳腺癌等病变发病率的逐渐升高与动物源食品中的性激素残留有关系[1]。各国政府相应出台了一系列的政策和标准来控制性激素的滥用,在此基础各种关于性激素的检测方法也逐步发展起来。如 GB/T5009.108畜禽肉中已烯雌酚的测定、SN/T1744-2006进出口动物饲料中己烷雌酚、已烯雌酚、双烯雌酚残留量的检验方法 (气相色谱串联质谱法)、Sadao N[2]等采用 GC/MS(气相色谱-质谱)同时测定了水中的六种性激素、崔晓亮[3]等利用超高效色谱/串联质谱测定了牛奶中12种糖皮质激素含量等。

2009-03-24

虞淼(1981-),男,硕士,助理农艺师,研究方向：农药质量分析、农药残留分析、农产品质量安全。