朱美娟,陶 红

(1.广东轻工职业技术学院食品系,广东广州 510300; 2.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510641)

用复性电泳技术研究金线鱼消化道蛋白酶的分布

朱美娟1,陶 红2

(1.广东轻工职业技术学院食品系,广东广州 510300; 2.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510641)

采用复性电泳和活力检测方法对 3组不同体重的金线鱼 (Nem ipterus virgatus)消化道蛋白酶的分布的研究表明：金线鱼各消化器官蛋白酶活性均随实验鱼体重增加而上升,但与体重增加不成比例。不同体重的金线鱼的消化道蛋白酶不仅存在活力差异,在种类和数量上也存在明显差别。3组鱼的消化道蛋白酶单位酶活力从高到低依次为幽门盲囊 ＞胃 ＞前肠 ＞中肠 ＞后肠 ＞肝胰脏,但以总活力计算时,仍以胃部蛋白酶的总活力最大。

金线鱼,复性电泳,消化道蛋白酶

1 材料与方法

1.1 实验材料

金线鱼 (N em ipterus virgatus) 由华南理工大学综合市场购得,为海捕冰鲜样品。金线鱼共分四组,第一、二和三组分别选择平均体重为 154.36± 12.18g,250.72±20.63g和 329.09±23.95g的鱼作为研究蛋白酶活力分布的研究原料,第四组选择平均体重为 188.41±10.14g的金线鱼作为消化道蛋白酶总活力在不同 pH下的分布研究的原料,每组选择体重、规格相近的 12条鱼为一组。

1.2 实验方法

1.2.1 粗酶液的制备 将鱼体解剖,取出整个消化系统。将整个消化系统分为胃、幽门盲囊、前肠、中肠、后肠五部分,去除其内容物,用预冷去离子水冲洗干净,剪碎。按样品重的 5倍加入预冷去离子水,在高速组织匀浆机中冰浴匀浆,匀浆液置于 4℃冰箱中提取 12h后,以 10000r/min的速率离心 30min,收集上清液,进行酶活力检测,24h内检测酶活力。全部操作除特别说明外,均在 4℃下进行。

1.2.2 消化道蛋白酶总活力在不同 pH下的分布参照 García-carreňo和 Haard(1993)的方法,并稍做修改[12]。用全消化道提取粗酶液。采用 0.1mol/L pH系统：pH2.0～3.0,采用 0.1mol/L Gly-HCl缓冲系统;pH3.0～8.0,采用Mcilvaine’s缓冲液 (0.1mol/L柠檬酸钠-磷酸钠),pH9.0～11.0,采用 0.1mol/L Gly-NaOH缓冲系统。分别在各pH下测定蛋白酶相对活力。以最高酶活力为 100%计算。

1.2.3 不同体重金线鱼消化道内各部位蛋白酶活力分布的比较 对不同体重的 I、II、III组 (n=12每组)金线鱼的各部位蛋白酶活力进行比较。胃部蛋白酶的活力测定采用 pH3缓冲系统,其余各部位皆采用pH9缓冲系统。

1.2.4 不同部位蛋白酶谱的检测 参照徐存拴和Díaz等复性电泳方法并修改分析[6-7]。采用 10%分离胶和 5%浓缩胶。本方法在制备聚丙烯酞胺凝胶时,将易被蛋白水解酶降解的明胶 (用作蛋白水解酶底物)共聚于分离胶里,电泳结束后,将与蛋白水解酶结合的 SDS用非离子去垢剂 (如 Triton X-100)除去,凝胶板里的蛋白水解酶即可恢复活性。在孵育期间,凝胶板所含的蛋白水解酶可将相应位置的明胶消化掉,胶板经固定后用 Coomassie Brillant 8250染色,整个胶板被染成蓝色,但被蛋白水解酶消化掉明胶的区域不再为 Coomassie Brillant R250着色而成为无色透亮区域,该区域即为相应蛋白水解酶的电泳位移。区域的大小和透光度代表该酶活性的强弱。

采用 10%分离胶、5%浓缩胶,样品在加样前加入1/3样品缓冲液 (78%甘油 10mL+3.5mL 0.5mol/L, pH6.8的 Tris-HCl+10g SDS+86.5mL双蒸水),每种样品加 2槽,每槽加样 100μg蛋白质 (唯肠道样品加样 10μg),电泳时电流不超过 10mA/板,4℃下电泳。电泳后用洗涤液 (3.03g Tris-base,12mL Triton X-100,500mL双蒸水、pH6.5)洗涤胶板 30min,用双蒸水洗 15min、胶板保温液 (0. lmol/L Gly,5mmol/L CaCl2分别调所需 pH)洗涤 5min后,放入保温液中置 37℃温箱中保温 24h。取出胶板放入固定液 (甲醇∶乙酸∶双蒸水 =5∶1∶4)中 30min,接着,放入染色液(含 0.1%Coomassie Brillant R250的染色液)里微振荡30min,然后放入脱色液(甲醇∶乙酸∶双蒸水 =3∶1∶6)至酶活性区域清晰透亮 (使用用过多次的旧脱色液脱色,效果更佳)。

1.2.5 蛋白酶活力测定 蛋白酶活力以 1g鲜活组织中所含酶每分钟水解酪素产生 1μg酪氨酸为一个酶活力单位,以μ/g·min表示。

蛋白酶的测定：参考行业标准 QB/T1803-93[8]。以酪蛋白为底物,胃蛋白酶的缓冲液改为 0.05mol/L pH2.5柠檬酸缓冲液;肝、肠、盲囊蛋白酶的缓冲液为0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl缓冲液,反应温度为 37℃,反应时间为 10min,于 722分光光度计检测波长680nm处的光吸收值。

本实验中蛋白酶的活性单位则为每克消化道组织(湿重)的酶活性。

2 结果与讨论

2.1 金线鱼消化道的蛋白酶总活力与 pH的分布

图 1显示了金线鱼全消化道的蛋白酶总活力和不同 pH下的分布。从图 1可以看出,蛋白酶在pH2～4和 pH9～10条件下出现了两个相对高的活力峰。表明在消化道中不仅存在酸性蛋白酶,还存在碱性蛋白酶;而且在本实验中碱性蛋白酶 (相对酶活为 100%)的活力要明显高于酸性蛋白酶的活力 (相对酶活为 62%)(P＜0.05)。说明在金线鱼的消化道中以碱性蛋白酶的活力占主体地位。对于鱼类全消化道蛋白酶的活力在不同 pH下的分布,鱼的种类不同,所得的结果不尽相同。在沙丁鱼 (Sardinops m elanostica)[9]、鲚鱼 (Engraulis encrasicholus)[10]、Scleropages for mosus(Osteoglossidae)[11]也都在 pH8～10的条件下出现了高的蛋白酶活力。但 Hidalgo对虹鳟鱼 (Oncorhynchus m ykiss)、乌颊鱼 (Sparus aurata)、金鱼 (Carassiusauratus)、欧 洲鳗 鱼 (Anguilla anguilla)、鲤鱼 (Cyprinus carpio)和丁岁鱼 (Tinca tinca)的全消化道蛋白酶活力在 pH下的分布进行了比较,虹鳟鱼和鲤鱼最高的蛋白酶活力出现在碱性条件下,而鳗鱼的最高酶活力则出现在酸性范围内[12]。Yasuo(1969)对酸、碱性蛋白酶的最适 pH做了研究,测定了几种鱼类的酸性蛋白酶和碱性蛋白酶活性,发现酸性蛋白酶的最适 pH为 2.6～3.4,碱性蛋白酶的最适 pH为 8.0～8.5。

图 1 金线鱼消化道的蛋白酶总酶活和pH分布

不同种的鱼其消化道的构造不同,有胃鱼类胃中作用最强的消化酶是胃蛋白酶,胃蛋白酶在较强的酸性范围内有较高的酶活力,其起作用的最适 pH在 2～3之间[11]。肝胰脏、肠道的蛋白酶种类较多,主要有糜蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶。关于肠道蛋白酶最适 pH报道较多,但都在 6.5～9.5之间,且多为微碱性。黄耀桐等 (1988)认为,有胃鱼类和无胃鱼类肠蛋白酶最适 pH是不同的,不同食性最适 pH也有一定差异,但大都在 7.0～9.0之间,皆在中性和弱碱性范围[13]。所以,从金线鱼的蛋白酶分布可以看出,金线鱼消化道存在酸性蛋白酶和碱性蛋白酶。

表 1 各消化器官蛋白酶活性(μ/g·min)

2.2 金线鱼消化道蛋白酶的分布

对 3组不同体重的金线鱼的 6个消化部位的蛋白酶活性的测定结果见表 1。

从表 1的测定结果分析表明,在相同的组别、不同的消化部位中,单位酶活力从高到低依次为幽门盲囊 ＞胃 ＞前肠 ＞中肠 ＞后肠 ＞肝胰脏,其中最适作用条件下幽门盲囊部位单位的酶活力显著高于其它消化部位的单位酶活力,其次是前肠,而中肠对蛋白质的消化能力显著低于前三个部位,后肠和肝胰脏则几乎不参加蛋白质的消化。由于肝胰脏的蛋白酶主要来自肠道并以无活力的酶原形式存在,因而酶活力最低。而以总酶活来看,由于胃部的重量显著高于前肠和幽门盲囊,所以仍以胃部的蛋白酶总活力最高。

对于同一消化部位,各消化器官蛋白酶活性均随实验鱼体重增加而上升,但与体重增加不成比例。不同的部位增长的速度不同,肝脏中蛋白酶活力增长最快,其三组蛋白酶活力比值为 1∶1.97∶2.49;肠道中以前肠蛋白酶活力增长较多。金线鱼消化道蛋白酶活力随体重变化的另外一个特点是：金线鱼体重从Ⅰ组变化到Ⅱ组,各部位蛋白酶活力增加明显,而从Ⅱ组到Ⅲ组,蛋白酶增加的速度明显减缓。不同体重各组实验鱼蛋白酶活性比值(Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ)在前、中、后各肠各段的比值分别为：1∶1.61∶1.86、1∶1.16∶1.52、1∶1.06∶1.52;在胃、肝胰脏、盲囊、全肠中的比值为：1∶1.23∶1.31、1∶1.97∶2.49、1∶1.29∶1.66、1∶1.28∶1.66。

研究表明,在鱼类的生长发育过程中,蛋白酶的活性将随着生长表现出总体上升的趋势,但对于不同品种的鱼类以及在不同消化器官中,蛋白酶活性的变化仍具有各自的特点[14-16]。Kuz’mina等 (1996)发现白斑狗鱼、河鲈、欧鳊和拟鲤的蛋白酶活力在生长初期有一个急剧上升的变化,而后增长速度变慢[14];白东清等 (1999)报道,鲤前肠蛋白酶活性在体重 25～42g时迅速上升,在 42～199g时下降,在 199～464g时又缓慢上升[15]。本研究发现金线鱼各消化器官蛋白酶活性均随体重增加而上升,肝胰脏、胃和前肠蛋白酶活性在体重 154～250g的生长阶段随体重急剧上升,生长后期 250～329g上升幅度较小,与倪寿文等对草鱼、鲤、鲢、鳙、尼罗罗非鱼的研究结果相近[16]。Kuz’mina等(1996)认为,鱼类不同生长阶段酶活力变化似乎与相对生长潜力(速度)存在某种对应[14]。

肠道中各种蛋白酶的作用部位多集中于前、中肠段,到后段肠道酶活性开始递减[17-18]。在本研究中,不同体重的金线鱼肠道蛋白酶活性分布均表现出相似规律：即前肠 ＞中肠 ＞后肠,但不同体重的实验鱼蛋白酶活性在肠道各段的哀减规律并不相同：体重低于 250g的实验鱼,后肠蛋白酶活性衰减较多;当体重高于 250g,中、后肠蛋白酶活性衰减明显减慢。根据不同体重的金线鱼肠道各段蛋白酶的分布规律推断,体重 154～250g的金线鱼,对蛋白质消化能力的提高可能主要源于蛋白酶分泌量的提高,而对于体重 250～329g的实验鱼,由于消化酶分泌量的提高并不十分显著,消化能力的提高可能主要源于肠道蛋白酶代谢失活速度减慢,有效作用时间延长。通过比较不同体重金线鱼肠道蛋白酶活性变化也能够发现,随体重增加,肠道各部位中以中、后肠道酶活性增加较多,表明随着金线鱼生长,中、后肠也在消化过程中逐渐起着越来越重要的作用。

鱼类的食性不同、摄食能力不同,消化道的构造差异较大,消化道的不同部位消化酶活性也有明显差异。吴婷婷等认为鳃鱼、鲢鱼蛋白酶活性由前肠向后肠逐渐降低,鳜鱼胃蛋白酶的活性比肠道高得多,鲢鱼前肠蛋白酶活性比后肠高,但差异不明显。青鱼、鲤鱼、草鱼和鲫鱼蛋白酶活性由前肠向后肠逐渐升高,其中青鱼前后肠蛋白酶活性差异显著,草鱼和鲫鱼前后肠之间蛋白酶差异不明显[19]。Hofer在墨桑比克罗非鱼[20],Vys在尖齿鲢[31],倪寿文在草鱼、鲤鱼、鲢鱼、鳙鱼、尼罗罗非鱼研究中都指出,肠蛋白酶活性由前肠向后肠逐渐降低[16]。周景祥研究得出鲤鱼、大眼鰤鲈蛋白酶的活性从前肠向后肠逐渐下降,黄毂鱼肠道蛋白酶活性中肠最高,后肠最低[17]。

2.3 金线鱼消化道蛋白酶分布的复性电泳

金线鱼消化道蛋白酶的分布规律从复性电泳的酶谱分布和亮带宽度得以证实。复性电泳结果见图2a和图 2b。

从图 2a酶谱上可以看出,对于胃蛋白酶(1～6泳道),I组的胃蛋白酶酶谱(图 2a中 1～2泳道)只有一条谱带,而 II和 III组胃蛋白酶酶谱(图 2a中 3～6泳道)却有三条谱带,说明在平均体重 154g的金线鱼胃中只有一种分子量大小的蛋白酶,而在平均体重为 250g和 329g的金线鱼胃中,却有两种分子量大小的蛋白酶,蛋白酶的种类和数量明显增多,这可能是引起蛋白酶急剧升高的主要原因;另一方面,从酶谱图亮带的宽度上,III组谱带的亮带区域明显宽于 II组,说明 III组胃蛋白酶的种类数量与 II组相同,但活力明显高于 II组。有报告证实,动物和人体内存在多种胃蛋白酶,人胃粘膜能分泌多种胃蛋白酶原, Samloff根据它们不同的电泳迁移率分刊命名为Pg1～Pg7,每种酶原切掉一定数量的肽段后都可以成为有活性的酶[21];而在鸵鸟的胃中至少有两种胃蛋白酶;Castillo-Yaňez(2004)也从沙丁鱼的胃中分离纯化出两种分子量不同的酸性蛋白酶[9]。从本实验的结果推断金线鱼的胃中可能存在两种以上蛋白酶,这些信息对于进行分离纯化实验是十分有益的。

图 2 不同体重的金线鱼消化道蛋白酶的复性电泳酶谱

与胃蛋白酶谱带分布相类似的结果也可以在其他器官、部位蛋白酶谱带中发现。肝胰脏、盲囊、全肠的 I组、II组、III组的蛋白酶谱带条数依次为：肝胰脏-2条,4条,5条;盲囊-4条,5条,6条;全肠-5条,6条,6条。而在肠道的前肠、中肠、后肠的 I组、II组、III组的蛋白酶谱带条数依次为：前肠-4条,5条,6条;中肠-4条,5条,5条;后肠-4条,5条,5条。肝脏中蛋白酶的亮带数量从 I组的两条,增加到II组、III组的 4条和 5条,使肝胰脏蛋白酶活力急剧上升。从以上结果可以看出,金线鱼消化道各部位蛋白酶随着体重的增加,其蛋白酶的种类发生了变化,也在逐渐增多。这是因为鱼类孵化后,随着消化器官的发育和分化,各种消化酶也开始先后生成。Chong等 (2002)发现绿盘丽鱼从孵化后 3d起,仔鱼体内就存在丝氨酸蛋白酶这样的碱性蛋白酶,并且活性明显加强,其它碱性蛋白酶有金属蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等,而有一种丝氨酸蛋白酶,却在孵化后 20～30d左右才可检测到[22]。

从前肠、中肠、后肠蛋白酶谱带 (图 2b中 1～18泳道)亮带的宽度比较可以看出,前肠蛋白酶亮带(图 2 b中 13～18泳道)的宽度明显大于中肠 (图 2b中 7～12泳道)和后肠(图 2b中 1～6泳道)。

3 结论

3.1 金线鱼的不同消化部位中,单位酶活力从高到低依次为幽门盲囊 ＞胃 ＞前肠 ＞中肠 ＞后肠 ＞肝胰脏,其中最适作用条件下幽门盲囊部位单位的酶活力显著高于其它消化部位的单位酶活力,但以总活力计算时,仍以胃蛋白酶的总活力最大。

3.2 各消化器官蛋白酶活性均随实验鱼体重增加而上升,但与体重增加不成比例。不同的部位增长的速度不同,肝脏中蛋白酶活力增长最快,肠道中以前肠蛋白酶活力增长较多。由复性电泳的结果表明,不同体重的金线鱼的消化道蛋白酶不仅存在活力差异,在种类和数量上也存在明显差别。

3.3 以上的结果可以看出,金线鱼消化道蛋白酶复性电泳的结果,不仅与活性检测方法的结果相一致,而且从蛋白酶的谱带的条数和亮带的区域大小,可以反映蛋白酶同工酶的种类的多少和活力的大小,更富说服力,且直观。另一方面,保温液的 pH和所含的化学成分可影响蛋白水解酶的活性,因此,通过调节保温液的温度、pH及保温时间和在保温液里加入酶的特异性底物、活化因子或抑制因子等来研究蛋白水解酶的性质、功能和鉴定蛋白水解酶的种类。对于这些蛋白酶的生化特性我们将采用其他方法(如双向复性电泳等)作进一步的研究。

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Activity distribution of digestive proteases fromNem ipterus Virgatus by non-denatured electrophoresis

ZHUM ei-juan1,TAO Hong2
(1.Guangdong Industry Technical College,Guangzhou 510300,China; 2.College ofLight Industry and Food Sciences,Guangzhou 510641,China)

The d is tribution and p rop e rties of three g roup s of Nem ip te rus virga tus we re s tud ied by non-dena tured e lec trop hores is.The results showed tha t the ac tivities of p rotease in a ll d iges tive organs went up w ith body we ight inc reas ing,but the re was not ra tio be tween the ac tivity and body we ight.Not only the ac tivity but a lso the sp ec ies and am ounts we re d iffe rent w ith the chang ing of body we ight.The p rotease ac tivity was in descend ing orde r, p ylorus caeca＞s tom ach＞foregut＞m idgut＞hindgut＞hep a top anc reas.But m ax im a l tota l p rote lytic ac tivity was found in s tom ach.

Nem ip te rus virga tus(Houttuyn);non-dena tured e lec trop hores is;d iges tive p roteases

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)02-0114-05

金线鱼 N em ipterus virgatus(Houttuyn)属鲈形目Percifor m es、金线鱼科 N em ipteridae,为暖温性鱼类,栖息于近底层,我国沿海均有分布,以南海分布最多,东海次之,黄海南部偶有捕获。南海区以北部湾、珠江口至海陵岛近海区产量较多,渔期全年[1]。金线鱼是底拖网作业的主要捕捞对象之一,也是刺网和钓业的重要捕捞鱼种。仅广东省茂名市电白县博贺渔港每天上岸的黄肚金线鱼就达几十吨[2],除一部分鲜食外,大部分被加工成鱼糜、鱼干、鱼露、鱼丸等制品,在加工过程中产生大量的内脏废物,引起环境污染。这些污染物成为限制鱼类加工业发展的主要问题。所以,寻找一条有效途径利用这些废弃物,解决环境污染问题迫在眉睫。大量研究证明,鱼类内脏含有丰富的蛋白水解酶,是食品工业中有效的生化工具。因此,金线鱼消化道蛋白酶的回收利用是解决其生产过程中一系列问题的有效办法。但是,有关金线鱼的研究,仅见黄梓荣和陈作志 (2005)、陈国宝等 (2002)、王雪辉等 (2004)及黄甫 (2006)等对金线鱼的生物学特征如最适捕捞长度、产卵期、资源现状、鱼鳞成分进行了研究[1-5],而其消化道蛋白酶的分布和活性的研究却鲜有报道。本文主要研究金线鱼消化道蛋白酶不同部位的活力分布规律及不同体重对蛋白酶活力分布的影响,为金线鱼消化道蛋白酶的回收、纯化及应用提供理论依据。

2009-04-01

朱美娟(1969-),女,实验师,研究方向：食品生物技术。