金建丽， 李伟航，2， 陆 灏， 刘泓玮

(1.牡丹江师范学院 生命科学与技术学院， 黑龙江 牡丹江 157011； 2.牡丹江市卫生学校， 黑龙江 牡丹江 157011)

拟赤梢鱼(Pseudaspiusleptocephalus)属脊索动物门、辐鳍鱼纲、鲤形目、鲤科、拟赤梢鱼属，是拟赤梢鱼属在我国仅有的一种鱼，在黑龙江中游分布最广[1]。因其脂肪少，肉质细腻，味道鲜美而深受消费者喜爱，为当地重要的经济鱼类[2]。目前，对拟赤梢鱼已有部分研究报道[3-6]，但对其消化系统中消化酶和免疫酶的研究未见报道。蛋白酶(PRO)、淀粉酶(AMS)、酯酶(EST)是生物体内3种重要的消化酶，是由消化道或消化腺分泌并起营养消化作用的一种特殊酶类。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)是生物体内重要的免疫酶，其中，SOD是抗氧化系统的重要成员之一，不仅能清除体内多余的自由基，降解溶酶体内的细菌及异物，并在免疫中发挥重要作用；POD是存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶，催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应，从而对细胞起保护作用[7]。笔者采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法对以上5种酶在拟赤梢鱼消化系统中的分布与活性进行研究，以期为拟赤梢鱼的基础生物学、消化生理特征研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 拟赤梢鱼 于2015年5月在牡丹江市镜泊湖捕获，共30条，雌、雄各15条，均为健康成体，体重(217.81±53.50)g，体长(24.88±1.49)cm。

1.1.2 仪器 高速冷冻离心机(Beck-man Coultertm AllegraTM 64R Centrifuge)，微量移液枪(Rainin Pipetlite Magnetic Assist Pipette SL-100、SL-1000，德国Eppendorf公司)，凝胶成像系统(MultilmageTM Light Cabinet Alpla Innotech Corporation，美国Alpha公司)，三恒多用电泳仪(ECP3000，北京六一仪器厂)。

1.1.3 药品 Tris、四甲基乙二胺(TEMED)、可溶性淀粉、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、甲叉双丙酰胺、琼脂糖、甘氨酸、溴酚蓝、醋酸钠、碘、丙三醇、冰乙酸、PMS、过硫酸铵、固蓝RR盐、碘化钾、α-醋酸萘酯、β-醋酸萘酯、NBT、CBR-250、联苯胺等，均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

采用PAGE方法对拟赤梢鱼消化系统的消化酶(PRO、AMS、EST)和免疫酶(SOD、POD)进行分离分析，并根据电泳图谱绘制出谱带分布和电泳迁移率表[8]。

2 结果与分析

2.1 PRO分布与活性

从图1、表1可知，PRO在拟赤梢鱼消化系统中共分离出迁移率为0.006～0.712的17条谱带(PRO1～PRO17)。食道分离出PRO1～PRO11、PRO13、PRO15～PRO17共15条谱带。前肠分离出PRO2～PRO11、PRO13、PRO15～PRO17共14条谱带。中肠分离出PRO3～PRO11、PRO13、PRO14、PRO16、PRO17共13条谱带。后肠分离出PRO3、PRO4、PRO6、PRO7、PRO9～PRO13、PRO15～PRO17共12条谱带。肝胰脏共有2条谱带，分别为PRO13和PRO15。PRO1为食道特有谱带，PRO14为中肠特有谱带，PRO12为后肠特有谱带。其中，PRO13为食道、前肠、中肠、后肠和肝胰脏共有谱带，电泳迁移率为0.111。拟赤梢鱼食道内PRO活性最高且谱带数目最多；肠道内PRO活性最高的为前肠，明显高于中肠和后肠，肝胰脏内PRO活性最低。5种组织中PRO活性依次为食道>前肠>中肠>后肠>肝胰脏。

图1 拟赤梢鱼消化系统PRO电泳图谱

Fig.1 Electrophoresis pattern of PRO in digestive system ofP.leptocephalus

2.2 AMS分布与活性

从图2、表2可知，AMS在拟赤梢鱼消化系统中共分离出迁移率为0.197～0.386的5条谱带(AMS1～AMS5)。在食道、前肠、中肠、后肠和肝胰脏中均分离出5条谱带，但各谱带的活性强弱不同，AMS5的活性最强，为主带，在中肠表现最强、前肠表现最弱。AMS3活性在中肠、后肠和肝胰脏均表现最弱。5种组织中，中肠和后肠的酶谱最为相似，除AMS3和AMS4，其余谱带的活性一致。5种组织中AMS的活性依次为后肠>中肠>前肠>食道>肝胰脏。

图2 拟赤梢鱼消化系统AMS电泳图谱

Fig.2 Electrophoresis pattern of AMS in digestive system ofP.leptocephalus

2.3 EST分布与活性

由图3、表3可知，EST在消化系统中共分离出迁移率为0.064～0.868的19条谱带(EST1～EST19)。EST在拟赤梢鱼消化系统的各组织中均有表达，食道中分离出EST2～EST8、EST12、EST13、EST15、EST16共11条谱带。前肠、中肠和后肠均分离出EST3～EST8、EST10～EST16共13条谱逞。肝胰脏中分离出EST1、EST2、EST4、EST6、EST7、EST9、EST12、EST15～EST19共12条谱带。EST15、EST16为5种组织共有谱带，EST10、EST11、EST14为肠道特有谱带，EST1、EST9、EST17、EST18、EST19为肝胰脏特有谱带。5种组织共有谱带中EST15、EST16的活性最强，为主带。5种组织中EST的活性依次为肝胰脏>前肠>中肠>食道>后肠。

图3 拟赤梢鱼消化系统EST电泳图谱

Fig.3 Electrophoresis pattern of EST in digestive system ofP.leptocephalus

2.4 SOD分布与活性

由图4、表4可知，SOD在消化系统中共分离出迁移率为0.088～0.716的11条谱带(SOD1～SOD11)。食道中分离出SOD1～SOD7、SOD10、SOD11共9条谱带。前肠中分离出SOD1～SOD7、SOD9、SOD11共9条谱带。中肠和后肠中均分离出SOD1～SOD4、SOD6、SOD7、SOD9、SOD11共8条谱带。肝胰脏中分离出SOD1～SOD4，SOD7～SOD9，SOD11共8条谱带。SOD1～SOD4、SOD7、SOD11为5种组织中共有谱带，其中SOD3、SOD4的活性最强，为主带。SOD10为食道特有谱带，SOD8为肝胰脏特有谱带。5种组织中SOD活性依次为前肠>中肠>食道>肝胰脏>后肠。

图4 拟赤梢鱼消化系统SOD电泳图谱

Fig.4 Electrophoresis pattern of SOD in digestive system ofP.leptocephalus

2.5 POD分布与活性

由图5、表5可知，POD在消化系统中共分离出迁移率为0.070～0.753的13条谱带(POD1～POD13)。前肠和后肠中均分离出POD3、POD5～POD7、POD9、POD11、POD12共7条谱带。中肠中分离出POD3、POD5～POD7、POD9、POD11～POD13共8条谱带。肝胰脏中分离出POD4～POD7、POD9～POD13共9条谱带。POD5～POD7、POD9、POD11、POD12为消化系统5种组织共有谱带。POD1、POD2、POD8为前肠特有谱带，POD4为肝胰脏特有谱带。5种组织中POD活性依次为肝胰脏>后肠>中肠>食道>前肠。

图5 拟赤梢鱼消化系统 POD电泳图谱

Fig.5 Electrophoresis pattern of POD in digestive system ofP.leptocephalus

3 讨论

3.1 拟赤梢鱼消化酶电泳谱带分布与活性

PRO是参与生物体内多种生物过程的重要水解酶，几乎所有脊椎动物消化道都含有类似的蛋白酶。拟赤梢鱼为无胃鱼类，消化道是消化蛋白质的主要部位。其消化系统蛋白酶活性以食道最高。肠道内以前肠中蛋白酶活性最高，明显高于中肠与后肠，呈逐渐递减趋势，与对鳜鱼等[9]的研究结果一致。拟赤梢鱼肝胰脏内蛋白酶活性明显低于肠道与食道，且活性较低，与李效宇等[10]对金鱼，白晓慧[11]对黑尾近红鲌的研究结果一致。

AMS是一种能够水解淀粉的重要酶类，广泛存在于动植物及微生物体内，功能都是分解淀粉。拟赤梢鱼消化系统淀粉酶活性以后肠最高，且明显高于其余组织。消化道的淀粉酶活性显著高于肝胰脏，与对鳜鱼等[9]的研究结果一致。拟赤梢鱼的淀粉消化主要是在肠道内进行，与胡思玉等[12]对昆明裂腹鱼的研究结果相符。

拟赤梢鱼消化系统的EST在肝胰脏中活性最强，且明显高于其余组织，谱带表达具有明显的组织特异性。肝脏除作为参与消化的腺体外，还是机体内最大的清除毒物的器官，活跃的脂类代谢使EST在肝脏中呈高强度表达，EST在各组织中的表达强弱与其生理功能相适应。

3.2 拟赤梢鱼免疫酶电泳谱带分布与活性

SOD是需氧生物抗氧化系统的一种重要酶类，消化道中SOD对随食物进入体内的细菌引起的歧化反应发挥重要作用，对提高机体的非特异性免疫具有重要意义[13]。SOD在拟赤梢鱼消化系统5种组织中均有表达，且都表现出较强的活性。SOD10为食道特有谱带，SOD8为肝胰脏特有谱带；同时，食道和肝胰脏都有谱带缺失现象。

POD是一类能利用H2O2氧化供氢体的氧化酶，广泛存在于动植物各种组织中，能清除氨基酸分解代谢以及糖醛酸合成代谢等过程中形成的过氧化物[14]。拟赤梢鱼消化系统5种组织中POD活性表现出明显的组织特异性。肝胰脏血流丰富、白细胞及吞噬细胞含量较多，其POD的活性最强，且明显高于其余4种组织，说明POD表达与组织的功能一致。

4 结论

研究结果表明，拟赤梢鱼消化系统5种组织中PRO活性依次为食道>前肠>中肠>后肠>肝胰脏；AMS活性依次为后肠>中肠>前肠>食道>肝胰脏；EST活性依次为肝胰脏>前肠>中肠>食道>后肠。SOD活性依次为前肠>中肠>食道>肝胰脏>后肠；POD活性依次为肝胰脏>后肠>中肠>食道>前肠；各种酶在消化系统中分布及活性均表现出明显的组织特异性，酶的表达强度与所执行的功能相关。