霍学云，苏 琳，郑永明

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，如今由肺癌及其转移瘤所致的病死率已占癌症病死率之首。尽早发现、诊断及治疗是降低肺癌病死率的有效途径，而要做到早发现、早诊断、早治疗就必须明确其发生、发展及转移机制。肺癌的形成是一个多阶段、多步骤的复杂过程。微小 RNA（microRNAs，miRNA)与肿瘤的发生明显相关[1]，在人类肿瘤中miRNA的表达水平异常或发生突变[2]。miR-125b-1定位于11q23-24杂合型缺失（LOH）的微小区域，这一区域在肺部肿瘤、乳腺癌和卵巢癌中存在突变或缺失[3]，提示其可能与肺癌的发生相关。目前对miRNA与肿瘤关系的研究中，通常只是鉴定miRNA的表达丰度，其核苷酸序列是否突变尚无报道。为了从DNA水平研究miR-125b-1基因异常与肺癌发生的关系，笔者应用聚合酶链反应-单链构象多态性 （PCRSSCP）分析方法检测人肺癌组织miR-125b-1基因的突变情况，并分析了其与肺癌患者临床病理生理特征和预后的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 119例肺癌组织标本取自笔者所在医院病理科存档的2004-06～2006-10的组织蜡块。其中男92例，女27例；年龄30～76岁，平均（56±12）岁。每例均有详细的临床资料和手术记录，所有患者术前均未进行任何抗肿瘤治疗。按照WHO标准（1999年第3版）进行组织学分类，鳞癌50例，腺癌51例，大细胞癌9例，小细胞癌9例；按国际抗癌联盟 (UICC，1997年第5版)TNM分期，T1期 34例，T2期 61例，T3期 22例，T4期 2例；N0期54例，N1期30例，N2期 31例，N3期 4例。另取同期手术的肺良性病变肺组织42例作对照，其中男28例，女 14 例；年龄 10～60 岁，平均（39±10）岁；支气管扩张14例，肺结核瘤13例，炎性假瘤11例，肺脓肿4例。

1.2 患者随访资料 以门诊、电话、随访信形式对119例试验组患者进行随访,随访时间至2007-05，有随访结果的有94例，失访25例。94例中，死亡人数(直接死于肺癌的患者)为63例，截尾人数（失访、死于其它原因或持续生存至本文总结时）为31例，中位生存期是41个月。

1.3 模板DNA的提取 石蜡包埋组织模板DNA的提取参考文献[4]进行。1%琼脂糖电泳鉴定，紫外分光光度仪测定OD值计算出DNA含量。取200ng作为PCR模板。

1.4 引物设计 根据ensembl数据库中的miR-125b-1基因序列，应用在线引物设计程序primer3（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）设计引物，并在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网站上比对，选择产物唯一性、大小228bp的引物。引物序列：上游5'-CGAACAGAAATTGCC TGTCA-3'，下游 5'-CAATCACCTCAGACAAACTTT CTT-3'，由上海生工生物技术公司合成。

1.5 PCR扩增 20 μl反应体系，含10×扩增缓冲液2.0 μl，4 种 dNTP 混合物 0.4 μl，引物混合物 2.0 μl，Taq DNA 聚 合 酶 0.1 μl，Mg2+1.2 μl，ddH2O12.3 μl，模板DNA2.0μl。PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃变性 30 s，56℃复性 30 s，72℃延伸 30 s，共 35个循环后，最后72℃延伸7min。反应完成后，取5μl反应液用1%琼脂糖凝胶电泳，观察PCR产物扩增情况，在预期位置有清晰扩增带之后进行SSCP。

1.6 SSCP分析 取10 μl PCR产物， 加入 10 μl变性剂 （95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚蓝），95℃变性5 min，立即于冰浴中骤冷，再于10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（120V，4℃电泳18～20 h)。电泳结束后将其浸在含0.5 μg/ml溴化乙锭的1×TBE缓冲液中染色30～45 min，在紫外灯下观察变性后的二条单链电泳迁移率，并比较肺癌患者和正常对照者的结果。

1.7 统计学处理 本组所得数据采用χ2检验、非参数统计中Spearman等级相关、Kaplan-Meier生存曲线分析和对数秩和检验进行分析，数据统计在SPSS13.0软件上进行。

2 结 果

2.1 DNA抽提结果 所抽提DNA样本浓度及纯度，均可用于后续实验研究（PCR反应）。

2.2 PCR扩增产物的鉴定 设计的miR-125b-1PCR产物长度228bp，其中包括含有成熟的miR-125b-1发夹结构前体序列及其两侧序列。在119例肺癌组织和42例肺良性病变组织中全部扩增成功,PCR扩增产物均呈228bp大小的清晰目的片段条带，由含EB的1%琼脂糖电泳验证，见图1所示。

图1 PCR扩增产物的电泳图M为对照物(100～500bp)；1～3为肺癌组织；N为癌旁正常肺组织

2.3 PCR-SSCP分析 119例肺癌组织和42例肺良性病变组织的PCR扩增产物进行SSCP后，在同一胶片中进行比较，单链带出现异常区带者，视为有突变。结果显示119例肺癌组织中PCR扩增产物有40例（34%）出现异常泳动区带，说明在扩增的靶片段中检测到碱基突变。见图2。

图2 PCR-SSCP电泳分析图ssDNA为单链DNA，dsDNA为残存双链DNA，→为异常泳动区带

2.4 基因突变与肺癌患者临床病理和生理特征之间的关系 肺癌组织中miR-125b-1基因突变与淋巴结转移呈显著性相关，N分期越高者，发生基因突变概率越高,进一步行Spearman相关分析显示两者呈显著性正相关（r=0.285，P<0.01）；与临床分期呈显著性相关，Spearman相关分析显示两者呈显著性正相关（r=0.241，P<0.01）。而 miR-125b-1 基因的缺失与肺癌患者细胞分化程度、病理类型、原发肿瘤分期等均无明显关系（P>0.05）。见表1。

2.5 肺癌组织中miR-125b-1基因突变与肺癌患者术后生存率的关系 将miR-125b-1基因突变组和未突变组进行Kaplan-Meier生存曲线分析和对数秩和检验，结果发现miR-125b-1基因突变组术后生存时间显著低于非突变组（P<0.05），见图3。

3 讨 论

微小 RNA（microRNAs，miRNA)是一类近年来新发现的长约22个核苷酸 （nt）的非编码的单链RNA分子，在生物中广泛存在，在进化中高度保守，在生长、发育、分化、增殖、凋亡等生理过程中发挥重要的调控作用。miRNA最新有关研究表明：miRNA与肿瘤紧密关联，已经证实miR-32、miR-125b-1、let-7与肺癌的发生相关：其中miR-32位于9q31.2，这一区域在许多肿瘤中是缺失高频区，包括肺鳞癌[5]、膀胱癌[6]、头颈部肿瘤[7]等，其表达在肺癌中降低。在本文119例肺癌组织中有40例发生突变，突变率34%；而在42例肺良性病变组织中未有突变。本文结果从分子水平说明miR-125b-1基因突变与肺癌的发生、发展可能有密切关系。

表1 miR-125b-1基因缺失与肺癌患者临床和病理生理特征的关系

图3 基因突变组和基因未突变组的Kaplan-Meier生存曲线

现有的研究表明：miR-125b-1是长约22个核苷酸（22nt）的非编码 RNA，它是由长 88nt、带有发夹结构的pre-miRNA剪切而成，pre-miRNA的序列和结构的变化对于接下来形成成熟的miRNA的剪切反应影响很大[8]，因此在miRNA加工途径中任何突变,都可能扰乱基因的正常调控而导致肿瘤的发生。总之miR-125b-1基因突变有可能是miR-125b-1表达丰度的下降的原因之一，或与其表达丰度的下降呈现协同作用，使成熟miR-125b-1在肺癌中的功能发生相应改变。

此外，本文比较了肺癌组织中miR-125b-1基因突变与肺癌患者的临床病理生理特征之间关系，发现基因突变与淋巴结转移有密切的关系 （P<0.05），且基因突变与淋巴结转移之间存在正相关关系，提示可能在肺癌细胞的转移过程中起重要作用，增加患者发生淋巴结转移的风险性。应用Kaplan-Meier生存曲线分析，发现基因突变是肺癌患者预后不良的危险因素，可能与肺癌进展的某些调控机制有关。

综上所述，本文结果提示miRNA基因可能参与了肺癌的发生、发展过程。碱基突变很可能改变miRNA的功能，从而诱发肿瘤，检测肿瘤组织特定miRNA序列是否突变，有利于了解肿瘤发生发展的机理。

[1]Croce CM，Calin GA.miRNAs，cancer,and stem cell division[J].Cell，2005,122(1):6-7.

[2]Hammond SM.MicroRNAs as oncogenes.Curr Opin Genet Dev，2006,16(1):4-9.

[3]Iorio MV，Ferracin M，Liu CG，et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer.Cancer Res，2005,65(16):7065-7070.

[4]张维铭.现代分子生物学实验手册.北京:科学出版社，2001.80-85.

[5]Kanazawa H，Ebina M，Ino-oka N，et al.Transition from squamous cell carcinoma to adenocarcinoma in adenosquamous carcinoma of the lung[J].Am J Path，2000,156:1289-1298.

[6]Sinoneau M，Aboulkassim T，LaRue H，et al.Four tumor suppressor loci on chromosome 9q in bladder cancer:evidence for two novel candidate regions at 9q22.3 and 9q31[J].Oncogene，1999,18:157-163.

[7]Beder LB，Gunduz M，Ouchida M，et al.Genome-wide analyses on loss of heterozygosity in head and neck squamous cell carcinomas[J].Lab Invest，2003,83:99-105.

[8]Bracht J，Hunter S，Eachus R，et al.Trans-splicing and polyadenylation of let-7 microRNA primary transcripts.RNA，2004,10(10):1586-94.

[2009-09-26收稿，2009-10-28修回]