姜绍通，孙 磊，罗水忠，潘丽军

(合肥工业大学生物与食品工程学院农产品分离工程研究所，安徽 合肥 230009)

复合防腐剂对腌制蔬菜中腐败细菌的抑制效果研究

姜绍通，孙 磊，罗水忠，潘丽军

(合肥工业大学生物与食品工程学院农产品分离工程研究所，安徽 合肥 230009)

对腌制蔬菜中的腐败菌进行分离与鉴定，结果表明：腌制蔬菜中腐败菌主要为6株细菌，其中4株球菌，1株链杆菌，1株杆菌，都为革兰氏阳性菌。对腐败菌的抑菌剂进行筛选与优化，结果表明：Nisin、脱氢醋酸钠、尼泊金复合酯钠对腐败菌有明显的抑制作用。正交试验优化得到复合防腐剂最佳配方为：Nisin 0.4g/L、脱氢醋酸钠0.3g/L、尼泊金复合酯钠0.2g/L。在该复配条件下对于实验中分离得到的6种腐败菌及食品中常见的腐败菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)都有良好的抑制效果，抑制率都在96%以上。

腌制蔬菜；复合防腐剂；抑菌

我国腌制菜起源于周朝，距今约有3000年历史[1]，是我国传统佐餐食品，袋装产品是其市场销售的主要形式。为保证货架期，生产过程通常采用高温灭菌结合添加苯甲酸盐等防腐剂进行。其过程往往导致腌制蔬菜脆度下降、色泽变暗，且风味变差。所以研究非热杀菌和高效安全的腌制菜防腐剂备受人们关注。王敏等[2]在研究中发现高盐酱腌菜坯致腐微生物主要为坚强芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。陈建初等[3]在研究中发现虽然热力杀菌对袋装榨菜有一定的防腐效果，但是添加一定的防腐剂是必要的。

新型高效的防腐剂的开发现今尤为重要，其中一些具有安全并且有广泛应用前景的防腐剂也广受人们的关注。Nisin作为一种新型的生物防腐剂具有安全、无毒的特性，但是抑菌谱较窄，其能抑制大部分G+菌及其芽孢的生长和繁殖，但对G－菌抑制效果不明显[4]。壳聚糖是一种天然高分子聚合物，具有高效抑菌能力，良好的成膜性，并且天然、无毒、无害，在食品的防腐保鲜方面有着较高的应用价值[5]。脱氢醋酸钠、尼泊金复合酯是高效、广谱、安全的防腐剂，其对真菌、细菌都有一定的抑制效果[6-7]。

本实验即通过对上述各种防腐剂成分及质量浓度的复合研究，旨在得到一种高效的复合防腐剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腌制蔬菜 安徽露仙调味食品有限公司；Nisin 浙江银象生物工程有限公司；尼泊金复合酯钠、脱氢醋酸钠 广州市安心生物制品有限公司；壳聚糖 青岛海普生物技术有限公司；富马酸钠 郑州瑞普生物工程有限公司。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 合肥工业大学生物与食品工程学院微生物实验室；腐败菌从腐败的腌制蔬菜中分离。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，加入20g/L琼脂为固体培养基(用于菌种分离)。

1.2 仪器与设备

SWCJCO双面无菌操作台 江苏净化设备有限公司；UV-1201紫外-可见光分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；250D数显光照培养箱 江苏金坛市正基仪器有限公司。

1.3 菌种的分离纯化与鉴定

菌种的分离方法参考文献[8]进行。菌种的初步鉴定参考文献[9]进行。

1.4 单一防腐剂对腌制蔬菜中腐败菌抑制作用研究

将Nisin、脱氢醋酸钠、尼泊金复合酯钠(尼泊金乙酯钠:尼泊金丙酯钠=1:1)、脱氢醋酸钠、壳聚糖按照国标最大添加量稀释成不同的质量浓度，添加到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，分别接种对数期生长的腐败菌1mL，培养12h，测定腐败菌的生长情况。

1.5 复配防腐剂对腌制蔬菜中腐败菌的抑制作用研究

在单因素试验的基础上，选择对于致腐菌有一定抑制作用的防腐剂质量浓度进行复合，进行正交试验。正交试验选用正交表L9(34)。因素及水平如表1所示。

表1 复合防腐剂优化的正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimizing compound preservative

1.6 应用实验

将优化后的复合防腐剂配方，按照实验的质量浓度加入腌制蔬菜中，包装，85℃杀菌。以不加入防腐剂的腌制蔬菜为对照，将其置于37℃恒温培养箱中培养，每2d测定其细菌总数，细菌总数测定：按照GB4789.2—1994《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》进行。具体实验步骤按照文献[10]进行。

1.7 分析方法

腐败菌生长的测定：比浊法，测定OD600nm值。用腐败菌的抑制率评价防腐剂的抑制效果。腐败菌的菌落数用标准曲线法[11]计算。

2 结果与分析

2.1 腌制蔬菜中腐败菌的分离与初步鉴定

取腐败的腌制蔬菜25g，无菌剪碎，于225g无菌水中用力振荡搅拌。稀释成不同倍数的溶液，于营养琼脂培养基上，37℃，培养24h后计数。其中腐败菌分离和初步鉴定结果如表2所示。

表2 腌制蔬菜中腐败菌的分离及初步鉴定结果Table 2 Separation and preliminary identification of spoilage bacteria in pickled vegetables

2.2 单一防腐剂对腌制蔬菜中腐败菌的抑制效果

2.2.1 Nisin对于腐败菌的抑制效果

图1 不同质量浓度Nisin对腐败菌的抑制效果Fig.1 Suppression effect of Nisin at various concentrations on spoilage bacteria

由图1可知，Nisin对1号、5号、6号菌有很好的抑制效果，当其质量浓度达到0.15g/L时，对这3种致腐菌的抑制率分别达到了70.59%、69.88%、91.83%，但是对于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，当Nisin质量浓度达到最大即0.5g/L时，其抑制率分别达到95.86%、86.20%。

2.2.2 脱氢醋酸钠对腐败菌的抑制效果

由图2可知，脱氢醋酸钠对所进行实验的5种腐败菌都有较好的效果，其中对于1号菌和6号菌，在脱氢醋酸钠质量浓度为0.2g/L时，抑制率就分别达到了95.57%和66.19%，对于5号菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，随着脱氢醋酸钠质量浓度的增大，抑菌效果迅速增强。当防腐剂质量浓度达到0.4g/L时，可以较强的抑制除金黄色葡萄球菌外的腐败菌。

图2 不同质量浓度脱氢醋酸钠对腐败菌的抑制效果Fig.2 Suppression effect of sodium dehydroacetate at various concentrations on spoilage bacteria

2.2.3 富马酸钠对于腐败菌的抑制效果

图3 不同质量浓度富马酸钠对腐败菌的抑制效果Fig.3 Suppression effect of sodium fumarate at various concentrations on spoilage bacteria

由图3可知，随着富马酸钠质量浓度的增大，对腐败菌的抑制效果逐渐增强，对1号及5号腐败菌的抑制效果较好，当质量浓度达到0.3g/L及以上时，基本可以完全抑制这两种菌。但是对于6号菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌，当其质量浓度达到最大，即质量浓度达到0.4g/L时，对金黄色葡萄球菌的抑制率仅有31.14%，对枯草芽孢杆菌的抑制率也仅有26.14%。

2.2.4 壳聚糖对于腐败菌的抑制效果

图4 不同质量浓度壳聚糖对腐败菌的抑制效果Fig.4 Suppression effect of chitosan at various concentrations on spoilage bacteria

壳聚糖对腐败菌的抑制效果如图4所示，壳聚糖由于其絮凝作用，在添加到液体培养基时，抑制效果比较明显，但是从实验过程可以看出，由于其会使液体培养基中菌体沉降，用于实际生产时，会影响产品的风味，所以没有考虑将壳聚糖作为复合防腐剂的成分。

2.2.5 尼泊金复合酯钠对于腐败菌的抑制效果

图5 不同质量浓度尼泊金复合酯钠对腐败菌的抑制效果Fig.5 Suppression effect of Nipagin composite sulfate at various concentrations on spoilage bacteria

尼泊金复合酯钠对腐败菌的抑制效果如图5所示，其对于1号菌有比较好的抑制效果，当质量浓度达到0.2g/L时，抑制率达到了89.63%，对于6号菌，金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌，在尼泊金复合酯钠最大质量浓度下才对其有明显的抑制效果，抑制率分别达到了61.10%、51.13%、57.62%。

综上所述，脱氢醋酸钠对实验的5种致腐菌均有良好的抑制作用，Nisin 对于1号、5号、6号菌具有良好的抑制效果，对于金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌随着添加质量浓度的提高，抑制效果增强比较明显，尼泊金复合酯钠对于所筛得的致腐菌有一定的抑制作用，但其与其他防腐剂复合会有较好的抑菌效果。

所以选择脱氢醋酸钠、Nisin、尼泊金复合酯钠作为下一步复合防腐剂的成分。

2.3 复合防腐剂最佳配方对于抗性较强菌种的正交试验结果

由实验过程中发现，6号菌，金黄色葡萄球菌是对于防腐剂抗性较强的菌种，所以以下选用这两种菌的抑制率作为正交试验的评价标准。并且对正交试验的结果进行方差分析，结果见表3、4。

通过正交试验设计及方差分析结果，可以得出各因素对金黄色葡萄球菌抑制效果的显著水平：Nisin质量浓度对金黄色葡萄球菌抑制效果影响极为显著，脱氢醋酸钠及尼泊金复合酯钠质量浓度对金黄色葡萄球菌抑制效果不显著。因素主次顺序为ACB，直观分析和计算最佳水平组合均为A3C2B2即添加复合防腐剂Nisin质量浓度0.4g/L，脱氢醋酸钠质量浓度0.25g/L，尼泊金复合酯质量浓度0.2g/L时对金黄色葡萄球菌抑制效果最好，抑制率达到了99.83%。同时可以得出因素对6号菌的抑制效果的显著水平，Nisin质量浓度高度显著，脱氢醋酸钠质量浓度影响显著，尼泊金复合酯钠质量浓度影响不显著。因素主次顺序为ABC，计算分析最佳水平组合为A3B3C2。即Nisin质量浓度为0.4g/L，脱氢醋酸钠质量浓度为0.3g/L，尼泊金复合酯钠质量浓度为0.2g/L，此时，6号菌抑制率可以达到99.94%。

表4 正交试验结果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experimental results

表3 正交试验结果极差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experimental results

综合上述分析，根据因素相对于每个实验菌种的实验结果的显著性不同，考虑成本、效果，复合防腐剂配方应为A3B3C2。即Nisin质量浓度为0.4g/L，脱氢醋酸钠质量浓度为0.3g/L，尼泊金复合酯钠质量浓度为0.2g/L。

2.4 验证实验

将优化后得到的复合防腐剂添加到腐败菌中，得到其对1号菌抑制抑制率达到99.57%，2号菌抑制率得到99.22%，3号菌抑制率达到99.87%，4号菌达到98.79%，5号菌达到99.84%，6号菌达到99.79%，金黄色葡萄球菌抑制率达到98.42%，枯草芽孢杆菌抑制率达到96.09%。

2.5 应用实验

按照复合防腐剂配方，将防腐剂加入到调配腌制蔬菜的料液中，调配，包装后于85℃下杀菌15min，于恒温培养箱37℃下培养16d，每2d测定细菌总数。其结果如图6所示。

图6 复合防腐剂处理前后腌制蔬菜中细菌总数变化趋势Fig.6 Change trends of total bacterial number in pickled vegetables treated by compound preservatives

由图6可以看出，空白组在储藏期间第8天～第10天，其细菌总数大于3×103CFU/g，已经腐败。但是当添加复合防腐剂时，腌制蔬菜的细菌总数在实验的16d内，一直处于140CFU/g以下。对比空白组，有很高的保鲜程度，说明复合防腐剂对于腌制蔬菜有很好的保鲜效果。

3 结 论

3.1 在腐败的腌制蔬菜中，其致腐菌有6种细菌，其中有4种球菌、1种链杆菌、1种杆菌。经革兰氏染色后全为阳性。

3.2 经过单因素及正交试验结果分析，得出在复合防腐剂(Nisin质量浓度为0.4g/L，脱氢醋酸钠质量浓度为0.3g/L，尼泊金复合酯钠质量浓度为0.2g/L)作用下，对于所进行实验的食品中致腐菌的抑制率都达到了96%以上。

3.3 将所筛选的复合防腐剂添加到腌制蔬菜中，在37℃下培养16d，其仍然具有较好的保鲜程度，可以起到延长货架期的目的。

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Suppression Effect of Compound Preservative on Spoilage Bacteria in Pickled Vegetables

JIANG Shao-tong，SUN Lei，LUO Shui-zhong，PAN Li-jun
(Institute of Agricultural Products Separation Engineering, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Separation and identification of spoilage bacteria from pickled vegetables indicated that there were six dominant Grampositive bacteria including four strains of coccus, one strain of streptobacillus and one strain of bacillus. Meanwhile, the screening and optimization of bacteriostatic agents on spoilage bacteria were conducted. An obvious suppression effect of Nisin,sodium dehydroacetate or sodium Nipagin on spoilage bacteria was observed. Moreover, a compound preservative was optimized to be 0.4 g/L Nisin, 0.3 g/L sodium dehydroacetate and 0.2 g/L sodium Nipagin ester through orthogonal test. This compound preservative exhibited an excellent suppression effect on six strains of bacteria separated from pickled vegetables and common spoilage bacteria such as Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis in food. The suppression rate could reach up to 96%.

pickled vegetable；compound preservative；bacteriostasis

TS255.36

A

1002-6630(2010)09-0054-05

2009-09-02

安徽省农业科学研究基金项目(08152317)

姜绍通(1954—)，男，教授，博士，研究方向为农产品生物化工。E-mail：jiangshaotong@yahoo.com.cn