于立梅，于 新，曾晓房，杨凤卿

(仲恺农业工程学院轻工与食品学院 ，广东 广州 510225)

野生山毛豆蛋白制备及体外消化模拟研究

于立梅，于 新，曾晓房，杨凤卿

(仲恺农业工程学院轻工与食品学院 ，广东 广州 510225)

通过碱提酸沉法制备野生山毛豆蛋白，并模拟人体消化环境，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶两步消化法分析山毛豆蛋白的消化行为。结果表明：山毛豆中蛋白质含量约为(47.12±0.35)%，大豆中蛋白质含量约为(44.17± 0.48)%，山毛豆含有18 种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸，从非必需氨酸酸来看，山毛豆蛋白与大豆蛋白有相似的氨基酸组分，氨基酸平衡状况较好，接近参考蛋白模式；山毛豆的体外消化率为(84.86±0.75)%，大豆的体外消化率为(91.71±0.88)%，山毛豆酶解液中的总氨基酸含量比大豆的略低，但山毛豆酶解液中甘氨酸和色氨酸含量比大豆酶解液高很多，游离氨基酸(FAA)含量比大豆的略高。

山毛豆；蛋白质；消化率

非洲山毛豆(Tephrosia vogeliiHook f)和山毛豆(Tephrosia candida)均为豆科蝶形花亚科，灰叶属多年生灌木，原产非洲，主要分布于北纬15°至南纬20°的广大地区。近10多年来，我国广东、广西、海南、云南、福建等省区大量种植山毛豆[1]。山毛豆种子是一种脂肪和蛋白含量双高的豆类。其所含的能量充沛，100g山毛豆种子最多可提供1513.34kJ的能量。其所含的营养丰富，其中不饱和脂肪酸含量高，人体必需脂肪酸亚油酸含量占总体脂肪酸含量的52.0%，占山毛豆种子质量的6.76%，其蛋白质含量高达38.73%，可作为廉价的食用或饲用蛋白质来源，满足生活、生产的需要[2]。

蛋白质对人体十分重要，各种食品中蛋白质含量是否丰富固然重要，但能否被人体利用或利用多少，是决定其营养价值的一个先决条件。消化率是动物从食物中所消化吸收的部分占总摄入量的百分比，是评价食物营养价值的重要指标之一。测定食物消化率主要有体外法和体内法。体内法测定的消化率能够比较真实的反映动物对食物的消化情况。但体内法测定方法复杂、时间长、费用高，而且对外界环境的要求较高，季节、温度、光照等都会影响消化率测定值。体外消化法是利用精制的消化酶或研究对象的消化道酶提取液在试管内进行的消化实验，其测定值可近似反映动物对食物的消化率[3-5]。目前，国外一些报道把豆类蛋白突出的降胆固醇效果归因于其难消化组分，特别是那些疏水性高的组分。可见，有必要了解豆类蛋白在消化道环境下的消化行为，及一些因素对该蛋白消化过程的影响。本研究通过模拟人体胃部消化环境的消化模型，分析野生山毛豆蛋白的消化情形，探讨不同酶／底物比对山毛豆蛋白的消化过程的影响，测定山毛豆的蛋白质体外消化率、总氨基酸的含量和游离氨基酸(FAA)的释放量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生山毛豆采于广东从化上坡；大豆 吉林粮油市场。

盐酸、三氯乙酸、氢氧化钠(AR级)；胃蛋白酶(1:10000) Sigma 公司；胰蛋白酶(1:250) Genview公司。

1.2 仪器与设备

CS101-1E电热鼓风干燥箱 重庆四达实验仪器有限公司；Agilent 1100液相色谱仪 美国安捷伦公司；中草药粉碎机 天津市泰斯特有限公司；DHS-3C型精密pH计、KDN-08C凯氏定氮装置 上海雷磁仪器厂；SHZ-82 水浴恒温振荡器 金坛市恒丰仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 山毛豆蛋白(SPI)的制备

脱脂山毛豆粉用蒸馏水(1:10，m/V)分散(搅拌)完全，之后用2mol/L NaOH溶液调节至pH10以上，室温下搅拌2h后离心(9000×g，20～30min)。离心所得的上清液经2mol/L HCl溶液调节至pH4.6，于4℃放置2h，之后离心。所得沉淀用蒸馏水洗3次，重新分散于蒸馏水，并调节至中性。该分散液经透析后冷冻干燥，即得山毛豆的分离蛋白[6-7]。

1.3.2 样品中蛋白质含量的测定

采用微量凯氏定氮法[8-10]。

1.3.3 山毛豆蛋白质的模拟体外消化

1.3.3.1 胃蛋白酶最适量的选择

分别称取0.5g山毛豆分离蛋白于3个消化管中，各加入不同量胃蛋白酶(酶与底物质量比分别为1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450) 的pH1.5 的0.05mol/L HCl溶液30mL，在37℃台式恒温摇床上保温3h后过滤，多次冲洗残留物，用凯氏定氮法测定残留物的蛋白质含量。通过计算样品蛋白质消化率，确定出胃蛋白酶的最适用量。

1.3.3.2 胰蛋白酶最适用量的选择

分别称取0.5g山毛豆分离蛋白于3个消化管中，用含有1:350(酶与底物质量比)胃蛋白酶活性单位的浓度为0.05mol/L 的HCl溶液做前处理，之后加0.2mol/L 的NaOH溶液处理消化液使之pH值等于6.8。再分别加入含不同胰蛋白酶(酶与底物质量比分别为1:150、1:250、1:350、1:450) 的0.05mol/L 的KH2PO4-NaOH 缓冲液。继续培养3h，测定样品的蛋白质消化率，确定出胰蛋白酶的最适用量。

1.3.3.3 胃蛋白酶- 胰蛋白酶复合处理法的消化程序参照参考文献[11-13]进行。

1.3.3.4 体外消化率的计算

式中：m1为样品蛋白质量/g；m0为消化后滤渣蛋白质量/g。

1.3.4 氨基酸组分分析的测定(包括总氨基酸和游离氨基酸)

氨基酸组分分析：精确称取一定量样品于特制水解管底部，加6mol/L 盐酸，真空封管后于(110±1)℃水解24h(色氨酸的水解条件为4mol/L 氢氧化钠溶液，(110±1)℃水解20h)，冷却后定容、过滤和蒸干，再加入0.02mol/L的盐酸在空气中放置30min，上安捷伦液相色谱仪测定18种氨基酸。游离氨基酸测定不用水解，酶解样品直接上安捷伦液相色谱仪测定。采用邻苯二甲醛(OPA) 柱前衍生反应。柱色谱条件：C18柱(4.0mm× 125mm)，柱温为40℃，流速为1.0mL/min，检测波长为338nm和262nm(脯氨酸)，流动相：A：20mmol/L乙酸钠溶液；B：20mmol/L乙酸钠溶液-甲醇-乙腈(1:2:2，V/V)。

2 结果与分析

2.1 山毛豆和大豆中蛋白质含量的测定

表1 山毛豆与大豆蛋白质含量的对比Table 1 Protein contents of Tephrosia candida and soybean

从表1可见，山毛豆中蛋白质含量约为(47.12± 0.35)%，大豆中蛋白质含量约为(44.17±0.48)%，山毛豆所含的蛋白质要比大豆的多。

2.2 山毛豆和大豆氨基酸成分及含量分析

理想的运动蛋白应满足必需氨基酸(EAA)和非必需氨基酸(NEAA)之间平衡良好和支链氨基酸含量丰富的要求。因此，食物蛋白质营养价值的高低不仅体现在必需氨基酸的种类是否齐全，而且体现在必需氨基酸之间的比例及必需氨基酸与总氨基酸(TAA)的比例是否适宜[14]。FAO/WHO推荐理想蛋白质模式为氨基酸组成EAA /TAA在40%左右，EAA/NEAA在0.60以上。山毛豆和大豆中必需氨基酸与非必需氨基酸含量见表2。

从表2可看出，山毛豆和大豆中都含有18种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸，山毛豆蛋白样品的蛋白质18种氨基酸总量为38.08%，其中，必需氨基酸含量为13.47%，非必需氨基酸含量为24.61%。山毛豆的EAA/(EAA+NEAA)=35.37%，EAA/NEAA= 54.73%，大豆的EAA/(EAA+NEAA)=42.85%，EAA/ NEAA=74.98%，与WHO/FAO提出的EAA/(EAA +NEAA)比值和EAA/NEAA比值分别为40%左右和60%左右的参考蛋白模式相对相近，因此属于优质蛋白。支链氨基酸(BCAA)包括：L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸都属于必需氨基酸，主要在骨骼肌中进行代谢，同骨骼肌的合成有着密切的关系。在运动中，支链氨基酸可以促进运动后恢复期蛋白质的合成代谢， 加速肌肉合成，减少肌肉组织的分解，有助于肌肉块的增大[15-16]。山毛豆中所含的支链氨基酸占到总氨基酸量的15%，大豆所含的支链氨基酸占总氨基酸量的13%。

表2 山毛豆和大豆中必需氨基酸与非必需氨基酸含量Table 2 Contents of EAA and NEAA in Tephrosia candida and soybean

2.3 山毛豆体外消化率分析

2.3.1 酶与底物比(E/S)对山毛豆蛋白体外消化过程的影响

任何一种酶反应的反应速率都受酶本身浓度及底物浓度的影响，酶浓度(或酶活力)越高，酶反应则越快，即达到催化终点也越快。如果底物浓度较高，则酶反应保持较高反应速率的时间也较长。本实验通过分别测量胃蛋白酶和胰蛋白酶降解山毛豆蛋白底物所释放出的氮含量，讨论在一定山毛豆浓度下，不同酶与底物之比对山毛豆的体外胃蛋白酶消化过程的影响，从而选出胃蛋白酶和胰蛋白酶的最适用量。

2.3.1.1 胃蛋白酶最适用量的选择

通过测量胃蛋白酶降解山毛豆底物所释放出的氮含量，讨论山毛豆质量一定(0.5g)，不同酶与底物质量之比(1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450)对山毛豆蛋白的体外胃蛋白酶消化过程的影响，结果如图1所示，从而选出胃蛋白酶的最适用量。

图1 不同底物胃蛋白酶质量比条件下的山毛豆蛋白质体外消化率Fig.1 Digestibility of Tephrosia candida protein digested by pepsin at varying dosages

由图1可见，随着底物与胃蛋白酶的比例不断增加，山毛豆的体外消化率不断减小，其减小的趋势与酶用量紧密相关。在较低的E/S比值下(如1:450)，山毛豆蛋白的体外消化率仅为75.24%。然而，随着E/S比的增大，氮的释放量不断增加，山毛豆蛋白的体外消化率也增大，E/S比值为1:350时，山毛豆蛋白的体外消化率为80.67%，之后趋于平缓。因此胃蛋白酶的用量应采用1:350。图1也显示，对于任何一种蛋白，其蛋白的体外胃蛋白酶消化率取决于所采用的胃蛋白酶酶量。当加酶量达到一定程度后，酶与底物的作用达到饱和，加大酶的用量所产生的作用较小。

2.3.1.2 胰蛋白酶最适用量的选择

通过测定胰蛋白酶降解山毛豆底物所释放出的氮含量，讨论山毛豆质量(0.5g)，不同酶与底物质量比(1:150、1:250、1:350、1:450)对山毛豆蛋白的体外胃蛋白酶消化过程的影响，结果见图2，从而选出胰蛋白酶的最适用量。

图2 不同底物与胰蛋白酶质量比条件下山毛豆蛋白质体外消化率Fig.2 Digestibility of Tephrosia candida protein digested by trypsin at varying dosages

由图2可见，随着底物与胰蛋白酶的比例不断增加，山毛豆蛋白的体外消化率也不断减小，其减小的趋势与酶用量紧密相关。随着E/S比值的增加，氮的释放量不断增大，山毛豆蛋白的体外消化率也增加，E/S比值为1:350时，山毛豆蛋白的体外消化率为84.53%，之后增加趋势缓慢。因此选胰蛋白酶的用量E/S应采用1:350。

2.3.1.3 胃蛋白酶- 胰蛋白酶复合处理法的消化分析

消化率是动物从食物中所消化吸收的部分占总摄入量的百分比，是评价食物营养价值的重要指标之一。本实验采用胃蛋白酶、胰蛋白酶两步体外消化法，首先用胃蛋白酶在酸性条件下完成食物在胃内的消化过程，再用胰蛋白酶在中性条件下继续消化，完成营养成分在小肠的消化过程，最后将已消化营养成分与未消化营养成分分开，结果见表3。

表3 山毛豆与大豆蛋白体外消化率Table 3 in vitro digestibility of Tephrosia candida protein and soybean protein

表3显示，在同等条件下进行水解，山毛豆蛋白的体外消化率 84.86%，大豆蛋白的体外消化率为 91.71%。山毛豆作为野生资源，来源广泛，市场价格低于大豆很多，消化率稍低于大豆，可以作为大豆的替代品，所以在食品和动物饲料中具有潜在应用价值。

2.3.2 山毛豆和大豆蛋白酶解液中的总氨基酸和游离氨基酸含量的测定

表4 山毛豆和大豆蛋白酶解液中的总氨基酸含量Table 4 Total amino acid contents in the separate hydrolysates of Tephrosia candida and soybean

蛋白质是构成人体细胞的主要成分，食物中的蛋白质进入人体后经过消化先分解成氨基酸，氨基酸是构建生物机体的众多生物活性大分子之一，是构建细胞、修复组织的基础材料。氨基酸能够为机体和大脑活动提供能源，氨基酸是一切生命之源。山毛豆和大豆酶解液中的总氨基酸和游离氨基酸(FAA)含量的分析结果见表4、5。

表5 山毛豆和大豆蛋白酶解液中的游离氨基酸(FAA)含量Table 5 Free amino acid contents in the separate hydrolysates of Tephrosia candida and soybean

由表4、5可知，山毛豆蛋白酶解液中的总氨基酸含量比大豆的略低，但山毛豆蛋白酶解液总氨基酸中的甘氨酸和色氨酸含量比大豆酶解液高很多，近来的研究表明，甘氨酸可通过作用于细胞膜上的甘氨酸受体(GlyR)防止枯否细胞过度激活，从而对多种原因引起的肝损害起明显的保护作用。色氨酸是一种必需氨基酸，可以防止烟酸缺乏症和增加血清素水平。在所有氨基酸中，色氨酸被认为是特定食品中含量最少的。虽然稀少，色氨酸是非常必要的，因为它会由肝脏转换成VB3(烟酸和烟酰胺)，这有助于防止烟酸缺乏症[17]。山毛豆蛋白酶解液游离氨基酸(FAA)含量比大豆的略高，由此也证明了山毛豆蛋白的体外消化率比大豆略低。因此山毛豆蛋白具有较大的潜在应用营养价值。

3 结 论

本研究通过模拟人体胃部消化环境的消化模型，分析了山毛豆蛋白的消化情形，对比了山毛豆和大豆蛋白质的体外消化率，测定了总氨基酸的含量和游离氨基酸(FAA)的释放量。结论如下：山毛豆中蛋白质含量约为(47.12±0.35)%，大豆中蛋白质含量约为(44.17±0.48)%，山毛豆所含的蛋白质要比大豆的多。山毛豆蛋白质模拟体外消化分析：在一定蛋白浓度下，随E/S之比的增加，氮的释放量不断增加，山毛豆蛋白的体外消化率也增加。胃蛋白酶最适量的选择为1:350，胰蛋白酶最适用量的选择为1:350。山毛豆蛋白质体外消化率(84.86± 0.75)%，大豆蛋白质体外消化率为(91.71±0.88)%，大豆蛋白的体外消化率比山毛豆高。山毛豆蛋白酶解液中的总氨基酸含量比大豆的略低，游离氨基酸(FAA)含量比大豆的略高。综上所述，山毛豆的蛋白质含量较高，但体外消化率不如大豆，但从成本来说，山毛豆价格远远低于大豆，所以山毛豆蛋白在食品和动物饲料中具有潜在应用价值。

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Preparation andin vitroDigestibility ofTephrosia candidaProtein

YU Li-mei，YU Xin，ZENG Xiao-fang，YANG Feng-qing
(College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agricultural and Engineering, Guangzhou 510225, China)

Tephrosia candidaprotein (TCP) was obtained through alkaline extraction and acid precipitation. Its digestion behavior was explored through two-step digestion using pepsin and trypsin in mimic digestion environment. Results exhibited that the content of soybean protein was (44.17 ± 0.48)%, the content of TCP was (47.12 ± 0.35)% and this protein was composed of 18 kinds of free amino acids including 8 kinds of essential acids. However, similar amino acid pattern between TCP and soybean protein was observed. The digestibility of TCP was (84.86 ± 0.75)%, while the digestibility of soybean protein was (91.71 ± 0.88)%. The content of total amino acids of TCP hydrolysates was lower than that of soybean hydrolysates, but the contents of some of the tested free amino acids were higher than those of their counterparts in TCP hydrolysates.

Tephrosia candida；protein；digestibility

TS214.9

A

1002-6630(2010)13-0060-05

2009-12-03

广东省科技计划资助项目(2008B030302001)

于立梅(1973—)，女，讲师，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：biyingwang2003@163.com