张 宇, 秦洪强, 吴仁安, 邹汉法

(中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析化学重点实验室,辽宁大连116023)

Ti-SBA-15介孔材料用于磷酸化肽的高效富集

张 宇, 秦洪强, 吴仁安, 邹汉法＊

(中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析化学重点实验室,辽宁大连116023)

结合基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)检测技术,考察了Ti-SBA-15介孔材料对β-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的选择性富集性能。实验结果显示,含Ti和Si物质的量比为0.08的Ti-SBA-15介孔材料可选择性地对β-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽进行选择性富集;对于β-酪蛋白和牛血清白蛋白物质的量比为1∶100的蛋白质酶解混合液,Ti-SBA-15仍能实现对其磷酸化肽的有效富集。上述结果表明,作为一种多孔、高比表面积的磷酸化多肽的选择性吸附材料,Ti-SBA-15有望在磷酸化蛋白质组的分析中得到广泛的应用。

Ti-SBA-15介孔材料;磷酸化肽;选择性富集;基质辅助激光解吸飞行时间质谱

Abstract:A titanium-incorporated SBA-15m esoporous m aterial(Ti-SBA-15)was synthesized viatheco-condensation of tetraethy lorthosilicate(TEOS)and tetrabutyl titanateusing surfactant P123as the template.Due to the existence of Ti in the fram ew ork of SBA-15,the synthesized Ti-SBA-15was applied as the selective adsorbent of phosphopep tides from the comp lex tryp tic digest of β-casein.The matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALD I-TO F MS)analysis show ed that the phosphopep tides ofβ-casein digest could be selectively enriched by the Ti-SBA-15with Ti/Simolar ratio of0.08,even under the interference of bovine serum album in(BSA)with the molar ratio of β-casein to BSA up to 1∶100.It can be concluded that the Ti-SBA-15show ed the specific adsorption toward the phosphorylated peptides,which providesgreat potential in the specificca pture of phosphopep tides.

Key words:titanium-incorporated SBA-15m esoporous material(Ti-SBA-15);phosphopeptides;selective enrichment;matrix assistedlaser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry(MALD I-TO F MS)

蛋白质的磷酸化过程是指蛋白质在激酶的作用下将三磷酸腺苷(ATP)或三磷酸鸟苷(GTP)上的磷酸基团转移到底物蛋白质上的过程,是生物体内一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式[1-5],也是蛋白质组学研究的热点之一。目前,蛋白质组学研究的主要技术手段是基于蛋白质酶解技术的多肽离子化质谱检测方法。然而,由于非磷酸化多肽对磷酸化多肽质谱离子化的抑制作用以及磷酸化蛋白质的含量相对较低,使得对磷酸化蛋白质的检测较为困难[6]。因此,发展基于新型吸附材料的磷酸化肽的选择性富集方法,避免蛋白质酶解产物中大量非磷酸化肽对磷酸化肽鉴定的干扰,对于实现规模化磷酸化蛋白质组的分析具有重要意义。

利用金属氧化物(TiO2和ZrO2)或固定化金属亲和色谱( IMAC)材料对磷酸化肽进行选择性富集的研究已见报道[7-11],然而,这些材料有限的比表面积在一定程度上限制了其在磷酸化多肽富集中的应用。介孔材料由于具有巨大的比表面积和2～50 nm的中孔结构,已被广泛地用作催化剂和吸附载体。前期研究也表明,利用介孔材料(MCM-41)的高比表面积,在其介孔表面引入Ti4+或Zr4+等金属离子可实现磷酸化肽的有效富集和选择性富集[12]。由于介孔材料在合成过程中可直接加入含Ti或Zr的无机单体,因而可一步合成出Ti或Zr均匀分布在硅骨架中的介孔材料。目前,此类金属介孔材料对磷酸化肽的选择性富集研究尚未见报道。本文系统地考察了内含Ti金属的介孔材料Ti-SBA-15对磷酸化肽的选择性富集作用。经基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALD I-TO F MS)检测证明,Ti-SBA-15不仅合成简单,而且具有很好的对磷酸化肽的选择性分离富集性能。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器:Autoflex MALD I-TO F MS购自德国B ruker D altonics公司。

试剂:聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(P123,EO20PO70EO20)购自德国BASF公司;醋酸(HAc)、醋酸钠(N aAc)、硅酸钠和四乙氧基硅烷(TEOS)购自中国医药集团上海化学试剂公司;钛酸正丁酯(Ti(O-n-Bu)4)购自A lfa-Aesar公司;乙酰丙酮购自中国医药集团上海化学试剂公司;牛β-酪蛋白(β-casein)、牛胰蛋白酶(trypsin)、牛血清白蛋白(BSA)和2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)均购自美国Sigm a-A ldrich公司;尿素、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(D TT)和碘代乙酰胺(IAA)购自美国B io-Rad公司;乙腈(ACN)和三氟乙酸(TFA)购自德国M erck公司。实验用水由美国M illipore公司M illi-Q超纯水系统制备。

1.2 实验方法

1.2.1 Ti-SBA-15的合成[13]

在10mL的小瓶中加入8.53g(3mmol)Ti(O-n-B u)4和3.06g(3mmol)乙酰丙酮,在室温条件下搅拌成均一的黄色溶液,即得钛前驱体Ti(O-n-B u)3(acac)。称取1.00g P123表面活性剂和1.69g乙醇于28mL HAc-N aAc缓冲溶液(0.52 mol/L HAc,0.27mol/L N aAc,pH4.4)中,在室温条件下搅拌至溶液澄清。然后在剧烈搅拌下,将2mL硅酸钠溶液(200m g/L SiO2(Si的物质的量为8.50mmol),60m g/L N a2O)加至上述表面活性剂溶液中。将表面活性剂溶液在室温条件下继续搅拌10m in后,加入含有8.50mmol TEOS和一定量Ti(O-n-B u)3(acac)的乙醇溶液1.69g。立即将由此得到的溶液移入40℃油浴中,继续搅拌24h。然后将得到的固液相混合物装入高压釜中,放入100℃烘箱中静置晶化24h。待冷却至室温后过滤,将所得固体在100℃烘箱中干燥3h,然后在550℃的静态空气中灼烧10h脱除P123模板剂。最后得到的样品即为Ti-SBA-15(n),其中n为Ti-SBA-15中钛(前驱体中的钛)和硅的物质的量比。

1.2.2 Ti-SBA-15孵育液的配制

称取10m g合成的Ti-SBA-15,并加入1mL含50%(体积分数,以下不做注明的均同此)ACN和6%TFA的混合溶液。振荡10m in后,在10 500 r/m in(13 500g)的速率下离心10m in,移除上清液。再加入1mL含50%ACN和6%TFA的混合溶液配成10m g/L孵育液,振荡混匀后备用。

1.2.3 蛋白质酶解

称取一定量的β-酪蛋白(或BSA),溶解于含8 mol/L尿素的100mmol/L的碳酸氢铵缓冲液(pH 8.3)中;蛋白质的最终浓度为10μmol/L。取1mL蛋白质溶液,加入10μL1mol/L D TT后在37℃水浴中加热2.5h。然后加入50μmol的IAA,在暗处于室温下静置0.5h。随后,将该蛋白质溶液用100 mmol/L的碳酸氢铵缓冲液稀释4倍,按m(β-酪蛋白或BSA)∶m(胰蛋白酶)=25∶1的比例加入胰蛋白酶。在37℃下酶解16h后,加入0.5%甲酸终止反应。分装后,在-30℃条件下冻存备用。

1.2.4 磷酸化肽的富集

将β-酪蛋白(或BSA)的酶解产物用含50%ACN和6%TFA的混合溶液稀释至1pmol/μL后取1μL加至50μL的Ti-SBA-15溶液中。振荡30 m in后,以10 500r/m in(13 500g)的速率离心10 m in,移去上清液。向底部沉淀物中加入150μL含50%ACN和6%TFA的500mmol/L N aC l溶液,振荡5m in后,以10 500r/m in(13 500g)的速率离心10m in,移去上清液。向底部沉淀物中再加入150μL含50%ACN和0.1%TFA的混合液,振荡5m in后,再以10 500r/m in(13 500g)的速率离心10m in,移去上清液。最后,将底部沉淀物用25μL 10%氨水超声洗涤10m in,再以10 500r/m in(13 500g)的速率离心10m in后,收集上清液至离心管中,冻干后保存。

1.2.5 MALD I-TO F MS检测

在上述离心管中加入5μL质量浓度为10～50 m g/mL的2,5-DHB溶液(含1%磷酸)。取该溶液0.5μL沉积于384孔点的抛光不锈钢MALD I靶上,形成共结晶。MALD I-TO F MS分析时采用氮气激光波长为337nm,加速电压范围为±20kV,于正离子线性模式下检测。

2 结果与讨论

2.1 不同Ti/S i比的Ti-SBA-15对磷酸化肽选择性富集的影响

Ti-SBA-15中Ti和Si的物质的量比(以下称Ti/Si比)是影响该介孔材料对磷酸化肽选择性富集能力的重要参数之一。在实验中采用Ti/Si比分别为0,0.01和0.08的Ti-SBA-15介孔材料进行考察。根据文献报道,β-酪蛋白的胰蛋白酶解产物中3个常见的磷酸化肽段分别是m/z2 061(β1)、m/z 2 556(β2)和m/z3 122(β3),其中β1和β2分别有一个磷酸化位点,β3有4个磷酸化位点[12]。从图1a可以看出,在未经富集的β-酪蛋白酶解产物中存在大量的非磷酸化肽的峰。当采用Ti/Si比为0的Ti-SBA-15介孔材料富集β-酪蛋白酶解产物时,图1b中既无磷酸化肽的峰,也无非磷酸化肽的峰。这说明在样品处理过程中,没有发生肽段的非特异性吸附。当采用Ti/Si比为0.01的介孔材料进行富集时,在β-酪蛋白酶解液中只检出β3和β2+3的峰(见图1c)。当Ti/Si比增加到0.08时,可检出β-酪蛋白酶解液中全部3个磷酸化肽的峰(见图1d)。这说明Ti-SBA-15骨架中的Ti对磷酸化肽的选择性富集起到决定性作用,且对多磷酸化肽的富集效果更佳。在以下实验中,均采用Ti/Si比为0.08的介孔材料。

图1 β-酪蛋白酶解产物(a)未经任何富集和经Ti/S i比分别为(b)0,(c)0.01和(d)0.08的Ti-SBA-15富集后的MALD I-TO F M S谱图(孵育液用量为50μL)Fig.1 MALD I-TO F M S spectra of β-case in digests(a)without and with enrichment by Ti-SBA-15with Ti/Simolar ratio of(b)0,(c)0.01and(d)0.08(incubation solution,50μL)

2.2 孵育液用量对磷酸化肽选择性富集的影响

图2 孵育液用量不同时T i-SBA-15(T i/S i比为0.08)富集β-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的MALD I-TO F M S谱图Fig.2 MALD I-TO F M S spectra of phosphopep tides from β-case in digests enriched by Ti-SBA-15(Ti/Simolar ratio of0.08)with different volumes of the incubation solution

采用含Ti/Si比为0.08的Ti-SBA-15介孔材料的孵育液,考察了孵育液用量对β-酪蛋白的酶解产物中磷酸化肽富集效果的影响。从图2可看出,将孵育液用量从25μL增加到50μL,β-酪蛋白酶解产物中富集到的3个磷酸化肽的峰强度有所增加;但是将孵育液用量继续增加到100μL时,磷酸化肽的峰强度没有太大变化。这说明利用Ti-SBA-15介孔材料富集时,用50μL的孵育液可以完全富集β-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽。

2.3 应用T i-SBA-15富集检测蛋白质酶解产物中磷酸化肽的最低检出限

进一步考察Ti-SBA-15介孔材料(Ti/Si比为0.08)对500,100和10fmol/μL的β-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的富集能力。如图3所示,MALD ITO F MS可以检测出100fmol/μLβ-酪蛋白酶解产物中的3个磷酸化肽;当β-酪蛋白浓度降低至10 fmol/μL时,质谱图上只有β3峰。因此,当用β3峰来定义检出限时,应用10m g/mL Ti-SBA-15(Ti/Si比为0.08)可富集检出浓度最低为10fmol/μL的蛋白质酶解液中的磷酸化肽。

图3 Ti-SBA-15(Ti/S i比为0.08)富集(a)500f mol/μL、(b)100f mol/μL和(c)10fmol/μLβ-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的MALD I-TO F M S谱图Fig.3 MALD I-TO F M S spectra of p hosphopep tides enriched from(a)500f mol/μL,(b)100 f mol/μL and(c)10f mol/μLofβ-case in digests by Ti-SBA-15(Ti/Simolar ratio of 0.08)

2.4 T i-SBA-15对磷酸化肽富集的特异性

采用Ti-SBA-15介孔材料对β-酪蛋白和BSA物质的量比分别为1∶50和1∶100时组成的酶解液混合物中磷酸化肽的富集特异性进行考察。从图4a可以看出,在没有经介孔材料处理的样品中,磷酸化肽几乎完全被非磷酸化肽掩盖;而采用Ti-SBA-15处理样品后,磷酸化肽被高选择性地富集而得到检测(见图4b,c),表明Ti-SBA-15对磷酸化肽有高选择性富集能力。

图4 (a)未经和(b,c)经T i-SBA-15(Ti/S i比为0.08)富集的β-酪蛋白和BSA酶解混合液的MALD I-TO F M S谱图Fig.4 MALD I-TO F M S spectra of the digest mixtures ofβ-case in and BSA(a)without and(b,c)with enrichment by Ti-SBA-15(Ti/Simolar ratio of0.08)

2.5 尿素和D TT对磷酸化肽富集的干扰

在进行蛋白质样品预处理中,经常会使用尿素和D TT溶液。因此,在实验中考察了分别向孵育液中添加2mol/L尿素和50mmol/L D TT时,Ti-SBA-15对磷酸化肽的选择性富集能力。从图5可以看出,即使在这两种干扰物存在的情况下,Ti-SBA-15也能从多肽混合物中高选择性地富集磷酸化肽。

图5 (a)2m o l/L尿素和(b)50mmol/L D TT存在条件下采用Ti-SBA-15(Ti/S i比为0.08)富集的β-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的MALD I-TO F M S谱图Fig.5 MALD I-TO F M S spectra of phosphopep tides fromβ-case in d igests en riched by Ti-SBA-15(Ti/Simolar ratio of0.08)in(a)2m o l/L urea and(b)50mmol/L D TT

3 结论

和传统的基于螯合作用的介孔材料相比,骨架含钛的Ti-SBA-15介孔材料不仅制备简单,可以有效地避免传统固载金属离子亲和色谱材料合成过程中二次反应嫁接金属离子的过程,而且也表现出对磷酸化肽的高选择性富集能力。因此,该材料有望在磷酸化蛋白质组的研究中发挥重要作用。

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Applications of Ti-SBA-15 mesoporous material in high performance enrichment of p hosp hop ep tides

ZHANG Yu,Q IN Hongqiang,WU Ren’an,ZOU Hanfa＊
(Da lian Institute of Chemical Physics,Key Laboratory of Separation Science for Analytica l Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Da lian 116023,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0123-05

＊通讯联系人:邹汉法,研究员,博士生导师.Tel:(0411)84399610,E-m ail:hanfazou@dicp.ac.cn.

国家自然科学基金项目(No.20735004).

2009-09-10

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00123