李 学 龙, 富 瑶 瑶, 孙 斯 宜, 付 绍 平, 鱼 红 闪, 金 风 燮

( 大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

人参皂苷Rg3是具有高抗癌活性的一种稀有皂苷，具有抑制肿瘤细胞的增殖、浸润，对肿瘤细胞的抗转移等药理作用[1]。但是它在植物人参中的含量仅为十万分之三，目前大多采用化学方法来制备。邵巍等[2]对Arthrobactersp.GS 0202菌株所产的人参皂苷-β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Rb1生成Rg3进行了研究；王亮等[3]研究了Arthrobactersp.3，phodopseudomonassp.18细菌所产胞外酶将人参二醇类皂苷转化为人参皂苷C-K的特种人参皂苷糖苷酶，发现不同温度发酵所产酶的种类不同；吴迪等[4]对Phycicoccussp.BXN 5-13细菌所产胞酶将人参皂苷Rb1转化生成Rg3进行了研究，证实该酶是胞内酶。

本实验主要研究新筛选出的Arthrobacter属中一种sp. 3细菌所产胞外酶，将人参二醇类皂苷转化生成Rg3的反应条件。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种和人参皂苷标准品

细菌Arthrobactersp.3，韩国KAIST提供；人参皂苷标准品Rg3、Rb1、Rc、Rd，由实验室提供。

1.1.2 主要仪器

薄层层析板Silica Gel-60-F254，德国Merck；高效液相色谱分析仪，Waters 2695-2996；色谱柱，Thermo Hypersil ODS2(200 mm×4.5 mm,5 μm)。

1.2 方 法

1.2.1 发酵培养基的配制

分别称取胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，溶于1 000 mL去离子水中，高压蒸汽灭菌20 min待用。

1.2.2 细菌的发酵

用接种针分别于液体发酵培养液中接菌2～3环，30 ℃振荡培养2 d，30 mL培养基内接菌液0.3 mL，置于35 ℃振荡培养箱中培养3 d。

1.2.3 粗酶的提取方法

将发酵液4 ℃下1 000 r/min离心8 min，弃沉淀，上清液中加入90 mL丙酮，4 ℃静置2 h。4 ℃ 1 000 r/min离心8 min，离心后弃上清液，白色沉淀即所要粗酶。加入2 mL HAc-NaAc缓冲液，振荡溶解，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.4 酶反应条件的优化

取粗酶液100 μL，分别与人参二醇类皂苷在不同条件下反应。

1.2.5 薄层层析法检验酶反应产物成分

每次点样1 μL，将点好样的薄层板放入层析缸的展开剂中。所用展开剂氯仿-甲醇-水溶液，体积比为7∶3∶0.5。

1.2.6 高效液相色谱法检验酶反应产物

进样量为10 μL；体积流量 1.0 mL/min；柱温，35 ℃；检测波长，203 nm。流动相A为乙腈，B为水，比例如表1所示。

表1 高效液相色谱流动相梯度洗脱程序Tab.1 The developing procedure of HPLC flowing form

2 结果与讨论

2.1 诱导物的确定

在30 mL发酵液中加入0.1 mg/mL的人参二醇类皂苷和芦丁各0.5 mL，振荡培养3 d，按“1.2.3”的方法提酶。取酶液和人参二醇类皂苷底物各0.1 mL，40 ℃反应24 h，加入0.2 mL水饱和正丁醇终止酶反应。振荡、离心1 min，取上层液作TLC检测。根据图1结果，选择人参二醇类皂苷作为诱导物诱导细菌产酶来研究产Rg3的最优反应条件。

2.2 酶反应条件的优化

2.1.2 酶反应底物质量浓度的优化

分别选择0.1、0.05、0.02、0.001 mg/mL人参二醇类皂苷0.1 mL与0.1 mL酶液，在40 ℃条件下反应24 h,加入0.2 mL 水饱和正丁醇终止酶反应。振荡、离心1 min，取上层液作TLC检测，结果如图2所示。由图2可以确定，0.1 mg/mL为酶反应最佳底物质量浓度。

Rb1、Rc、Rd、PPD、Rg3、F2均为人参皂苷标准品； 1、2为芦丁和人参二醇类皂苷诱导物图1 加入不同诱导物的酶反应TLC检测Fig.1 Effect of inducer on enzyme activit

Rb1、Rc、Rd、PPD、Rg3、F2分别为人参皂苷标准品； 1～4分别为0.1、0.05、0.02、0.001 mg/mL人参二醇类皂苷作底物的反应产物

2.1.3 酶反应时间的优化

0.1 mL酶液在40 ℃条件下与0.1 mL的0.1 mg/mL底物分别反应22、24、26、28 h，反应终止时加入0.2 mL 水饱和正丁醇。振荡、离心1 min，取上层液作TLC检测，结果如图3所示。由图3确定，24 h为最佳酶反应时间。

2.1.4 酶反应温度的优化

0.1 mL酶液和0.1 mg/mL人参二醇类皂苷底物分别于20、30、40、50 ℃反应24 h，终止酶反应时加入0.2 mL 水饱和正丁醇。振荡、离心1 min，取上层液作TLC检测。结果如图4所示。由图4可以确定，40 ℃为最佳酶反应温度。

2.1.5 优化反应条件后的产物鉴定

根据上述优化反应条件，即以人参二醇类皂苷为底物，质量浓度为0.1 mg/mL，40 ℃反应24 h后加入0.2 mL 水饱和正丁醇终止反应。振荡、离心1 min，取上层液作TLC检测，结果如图5所示。由图5可以确定上述条件即为酶转化生产Rg3的最优条件。

Rb1、Rc、Rd、PPD、Rg3、F2分别为人参皂苷标准品；1～4分别为反应22、24、26、28 h的产物图3 不同反应时间的TLC检测图Fig.3 Effect of reaction time on enzyme activity

Rb1、Rc、Rd、PPD、Rg3、F2为人参皂苷标准品； 1～4分别为20、30、40、50 ℃下的反应产物图4 不同温度下的酶反应TLC检测Fig.4 Effect of reaction temperature on enzyme activity

Rb1、Rc、Rd、PPD、Rg3、F2为人参皂苷标准品； s1为条件优化后的反应产物图5 酶反应条件优化后产物的TLC检测Fig.5 Hydrolysis of ginsenoside PPD type under the optimal condition

2.2 HPLC检测酶解产物的成分

将“2.1.5”反应后溶液用水饱和1 mL正丁醇萃取、蒸干，溶于1 mL甲醇(色谱纯)，摇匀，用直径0.45 μm微孔滤膜过滤，即得上样液。HPLC图谱如图6所示。通过反应条件的优化，Rg3的生成率较高，为21%。

图6 酶反应后的HPLC谱图Fig.6 Enzymatic reaction product on HPLC

3 结 论

为得到把人参二醇类皂苷转化为Rg3的特种人参皂苷糖苷酶，对细菌Arthrobactersp.3进行了发酵诱导物筛选和酶反应条件的研究。结果显示，采用0.1 mg/mL人参二醇类皂苷作为诱导物时细菌产酶的酶活较高；反应体系中底物为0.1 mg/mL，温度40 ℃、反应24 h时Rg3的生成率最高，在最适条件下对酶反应后人参皂苷进行HPLC检测，底物的转化率约为21%。

[1] 金凤燮. 天然产物生物转化[M]. 北京:化学工业出版社, 2009：79-81

[2] 邵巍,金风燮,鱼红闪. GS0202菌产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶条件及其酶的反应条件[J]. 大连工业大学学报, 2008, 27(1):30-33.

(SHAO Wei, JIN Feng-xie, YU Hong-shan. Production and characterization of ginsenoside-β-glucosidase from bacteria GS0202[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2008, 27(1):30-33.)

[3] 王亮,于小溪,鱼红闪,等. 人参二醇类皂苷转化成C-K细菌的研究[J]. 大连工业大学学报, 2008, 27(1):22-25.

(WANG Liang, YU Xiao-xi, YU Hong-shan, et al. Transformation of protopanaxdiol saponin to compond-K[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2008, 27(1):22-25.)

[4] 吴迪,孙斯宜,鱼红闪,等. 新细菌转化生产人参皂苷Rg3的条件研究[J]. 大连工业大学学报, 2009, 28(2):80-83.

(WU Di, SUN Si-yi, YU Hong-shan, et al. Transformation of protopanaxadiol saponin to ginsenoside-Rg3by Phycicoccus sp. BXN5-13[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2009, 28(2):80-83.)