李 翠 翠, 庄 子 瑜, 刘 廷 强, 鱼 红 闪, 金 凤 燮

( 大连工业大学 生物与食品工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

人参皂苷是人参的标志性活性成分之一，已鉴定结构的人参皂苷有60多种。人参皂苷的生理活性,决定了它的食用和药用价值[1]。人参口服之后，其皂苷糖基被肠道菌和消化系统的酶水解成低糖基的皂苷，吸收起药效[2]，如Rb1口服后转化为人参稀有皂苷C-K。但是这种体内的转化受到个体各种因素的约束，转化微量。为了在体外得到高活性的人参稀有皂苷，本实验室研究了人参皂苷糖苷酶，张春枝等[3-4]研究了人参植物茎叶的人参皂苷糖苷酶；鱼红闪等[5]发现了Aspergillussp.g48p来源的一种人参皂苷糖苷酶，该酶能水解人参皂苷Rb1、Rb2和Rc的第3碳上的β-葡萄糖苷基，也能水解Rb1第20碳上的β-葡萄糖苷基、Rb2第20碳上的α-吡喃阿拉伯糖苷基和Rc的第20碳上的α-呋喃阿拉伯糖苷基，生成稀有人参皂苷C-K，定名为人参皂苷糖苷酶I型。本文主要研究真菌sp.g848p发酵所产生的人参皂苷糖苷酶的分离提纯、酶的特性以及将人参二醇类皂苷转化为人参皂苷C-K的酶反应。

1 材料与方法

1.1 材 料

人参皂苷标准品C-K、PPD皂苷(人参二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd的混合物)；薄层层析板Silica Gel 60-F254；DEAE-Cellulose离子交换树脂；标准蛋白。

1.2 方 法

1.2.1 微生物培养产酶

菌种为真菌 sp.g848，大曲中筛选。

将4%的麦芽汁中加入相当于1%的人参提取物,加热灭菌,冷却接菌，在28 ℃通风搅拌培养4～6 d；冷冻离心除菌，收集上清液，向上清液中徐徐搅拌加入70%饱和度的硫酸铵、在4 ℃过夜、离心收集沉淀，用少量缓冲液溶解沉淀，在0.02 mol/L pH 5.0 NaAc-HAc缓冲液中透析除盐，再一次离心得上清，用上述缓冲液定容至1/10体积的发酵液，即为粗酶液。

1.2.2 皂苷糖苷酶提纯

酶的提纯是通过DEAE-Cellulose离子交换柱分离，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、切割单带的方法。向预处理过的DEAE-Cellulose离子交换柱中缓慢加入8 mL粗酶液，分别用0.02 mol/L pH 5.0 NaAc-HAc 缓冲液、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L KCl溶液各50 mL进行梯度洗脱，测定紫外吸光值，分离提纯酶蛋白。选取紫外吸光值(OD值)较高的试管，从中取出0.1 mL酶液，以0.1 mL 的0.5%人参皂苷PPD为底物，进行酶反应，TLC检测，并观察结果。对DEAE-Cellulose离子交换柱分离纯化后的具有皂苷糖苷酶活力的馏分，采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳法进一步纯化。将在凝胶上形成单带的酶蛋白切割后，溶于0.02 mol/L pH 5.0 NaAc-HAc缓冲液；充分溶解后，经高速冷冻离心，除去不溶性沉淀，所得上清液为进一步纯化的皂苷糖苷酶，用于酶性质的研究和酶蛋白分子质量的测定。

1.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子质量

实验采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯皂苷糖苷酶并测定分子质量。浓缩胶质量分数为5%，工作电压为30 V；分离胶质量分数为12%，工作电压为60 V。电泳约2 h，考马氏亮蓝染色。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中使用的标准蛋白是混合蛋白质包括：phosphorylase-b (97.2 ku),albumin (66.4 ku)，ovalbumin (44.3 ku)，carbonic anhydrase (29.0 ku)，trypsin- inhibitor(20.1 ku)，α-lactalbumin (14.3 ku)。

1.2.4 薄层层析法

微量点样，展开剂V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5，H2SO4水溶液显色，分析酶活，确定最适的酶反应条件[6]。

1.2.5 最适酶反应条件的研究

以人参二醇类皂苷PPD为底物，取0.02 mL 0.5%的PPD与等体积酶液反应，分别在12、18、24、30、36、48、72 h取样，测定酶活力。在最适反应时间的基础上，取等体积pH 为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的底物溶液与酶液混合，在40 ℃反应24 h，测定酶活力。在酶水解最适反应时间、最适pH基础上，取等体积底物溶液与酶液混合，分别在30、35、40、45、50、55、60 ℃下反应24 h，测定酶活力。

2 结果与讨论

2.1 酶的纯化

2.1.1 DEAE-Cellulose 离子交换柱分离提纯皂苷糖苷酶

采用自动部分收集器收集洗脱液，每3 min收集1管，每管收集3 mL，紫外分光光度计在280 nm测定各管OD值，最后选取OD值较高的试管进行下一步试验，所得OD值如图1所示。

图1 分离的各梯度酶的紫外吸光值Fig.1 The OD of purify enzyme

根据图1所示各梯度紫外吸光值，选取峰值管，即1、21、34、36、39、41、42、59、75、78、90、92、107管的洗脱液，进行酶反应，反应后用TLC法检测酶的活力，结果如图2所示。

C-K，标准品；1、21、34、36、39、41、42、59、75、78、90、92、107，分离的酶液管号

由图2可知，其中39、41、42、59号管均能将人参二醇类皂苷PPD转化为人参皂苷C-K，但只有41、42号管转化的效果最好。

2.1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化皂苷糖苷酶

经DEAE-Cellulose 离子交换柱分离纯化后的具有酶活力的酶蛋白——39、41、42、59号管酶，采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳法进一步纯化。只有41、42号管在聚丙烯酰胺凝胶上形成单带,即酶的纯度较高。但是为了进一步纯化酶，将单带的酶蛋白对照未染色的凝胶切割，充分溶解后，经高速冷冻离心，除去不溶性沉淀，所得上清液为进一步纯化的皂苷糖苷酶，用于酶蛋白分子质量的测定。

2.2 皂苷糖苷酶的分子质量的测定

将经过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的皂苷糖苷酶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时使用标准蛋白。电泳约2 h，考马氏亮蓝染色，结果如图3所示。

41、42，酶液的管号

根据图3测量标准蛋白的迁移率，作出标准曲线如图4所示。图4中横坐标为相对迁移率，纵坐标为蛋白质的分子质量，所得的标准曲线回归方程是lgY=-1.115 5X+2.027 6。

图4 标准曲线Fig.4 The standard curve

根据电泳图测量41、42管的迁移率为0.24，带入回归方程中计算得该酶的分子质量为74.0 ku。

2.3 提纯酶的研究

2.3.1 pH对酶的影响

以0.5%的人参二醇类皂苷PPD为底物，与等体积的纯酶液混合，40 ℃反应24 h，TLC检测如图5所示。

图5 pH对酶反应的影响Fig.5 Effect of pH on enzyme reaction

pH为5.0时，底物PPD中Rb1、Rb2、Rc基本能全部转化，即人参二醇类皂苷PPD水解的量最大，生成的人参皂苷C-K最多，因此pH 5.0时酶的活性最好。

2.3.2 温度对酶反应的影响

以0.5%人参二醇类皂苷PPD为底物，与等体积纯酶液混合，pH 5.0，分别在30、35、40、45、50、55、60 ℃反应24 h，检测酶活如图6所示。

图6 温度对酶反应的影响Fig.6 Effect of temperature on enzyme reaction

根据图6所示，50 ℃时酶反应最彻底，底物PPD中Rb1、Rb2、Rc基本能全部转化，但是酶在50 ℃时不稳定，酶在45 ℃时，转化人参皂苷PPD生成人参皂苷C-K的量仅次于50 ℃，所以最适的酶反应温度定为45 ℃。

2.3.3 时间对酶反应的影响

以0.5%人参二醇类皂苷PPD为底物，与等体积纯酶液混合，pH 5.0、45 ℃反应，分别在12、18、24、30、36、48、72 h取样，酶活力如图7所示。

图7 反应时间对酶反应的影响Fig.7 Effect of time on enzyme reaction

由图7可见，酶反应24 h时，底物人参二醇类皂苷PPD水解转化量最大，即产物人参皂苷C-K生成量最大，因此最适酶反应时间为24 h。

3 结 论

真菌sp.g848p发酵产生的把人参二醇类皂苷PPD转化为人参皂苷C-K的酶是一种特异的人参皂苷糖苷酶。该酶能水解人参二醇类皂苷PPD中Rb1、Rb2和Rc的第3碳上的β-葡萄糖苷基，该酶经DEAE-Cellulose离子交换柱,分离得到具有转化人参二醇类皂苷PPD酶活力的水解酶，进一步通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到纯酶。该酶分子质量约为74.0 ku,最适反应时间为24 h，最适反应温度为45 ℃、最适pH为5.0。

[1] LI T S C, MAZZA G, COTTRELL A C, et al. Gisenosides in roots and leaves of American ginseng[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1996, 44(3):717-720.

[2] KOHDA H, TANAKA O. Enzymic hydrolysis of ginseng saponins and their related glycosides[J]. Yakugaku Zasshi, 1975, 95(2):246-249.

[3] ZHANG Chunzhi, LI Dai, YU Hongshan, et al. Purification and characterization of picied-β-glucosidase fromAspergillusniger[J]. Process Biochemistry, 2007, 42:83-88.

[4] ZHANG Chunzhi, YU Hongshan, BAO Yongming, et al. Purification and characterization of ginsenoside-β-glucosidase from ginseng[J]. Chemical Pharmmacelltical Bulletin, 2001, 49(7):795-798.

[5] YU Hongshan, ZHANG Chunzhi, LU Mingchun, et al. Purification and characterization of new special ginsenosidase hydrolyzing multi-glycisides of protopanaxadiol ginsenosides, ginsenosidase type I[J]. Chemical Pharmmacelltical Bulletin, 2007, 55(2):231-235.

[6] YU Hongshan, GONG Jinmei, ZHANG Chunzhi, et al. Purification and characterization of ginsenoside -α-rhamnosidase[J]. Chemical Pharmmacelltical Bulletin, 2002, 50(2):175-178.