蔡其刚，马利青

(青海省畜牧兽医科学院，青海西宁810016)

龚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的重要机会致病性原虫，可寄生于人和动物的除红细胞外的有核细胞内，引起弓形虫病(Toxoplasmosis)[1]。猫及猫科动物是惟一可从粪便排出弓形虫卵囊的动物，猫在弓形虫传播给绵羊和其他动物中起着重要作用。

P30蛋白又称表面抗原1(SAG1)，为龚地弓形虫速殖子期特异性蛋白，能够刺激机体产生IgG、IgM及多种细胞因子，具有重要的抗原性[2]。Dzierszinski F等根据基因敲除试验认为P30可能是决定虫株毒力的重要因素之一[3]。为了摸清青海省绵羊中弓形虫病的感染情况，我们运用分子生物学方法克隆、表达、纯化重组 GST-SAG1，然后以GST-SAG1作为 ELISA诊断抗原，建立了 ELISA诊断试剂盒，利用建立的 ELISA方法对采自青海省的绵羊进行了弓形虫病的血清学诊断，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 抗原：GST-SAG1由日本国家原生动物疾病研究控制中心提供，青海省畜牧兽医科学院兽医研究所生物技术研究室保存。

阴、阳性血清：均为日本国家原生动物疾病研究中心玄学南教授惠赠，青海省畜牧兽医科学院兽医生物技术室保存。

被检血清：2 402份被检血清均采自青海省，以颈静脉采集，采集后立即离心(3 000 r/min离心15 min)，血清析出后进行收集，-20℃冷冻保存待检。

其他试剂和耗材：均购自国内和Sigma公司供应商。

1.2 重组蛋白的表达、纯化 将编码 T.gondii SAG1的基因克隆至pGEX-4T-3质粒，然后转化到E.coli，获得 GST-SAG1融合蛋白。GST-SAG1融合蛋白再用8 mol/L的尿素缓冲液透析复性，然后用于T.gondii的 ELISA诊断中。

1.3 抗原的包被 抗原GST-SAG1和GST，分别按5 μ g/mL剂量加到包被液中(50 mmol/L Carbonate-Bicarbonate Buffer，pH 9.6)，混匀后加到96孔平底微量板(Castor)的孔里，每孔 50 μ L，并且在4℃条件下培养过夜。

1.4 封阻 用含有0.05%Tween-20的 1×PBS冲洗1次后，用含3%脱脂乳的封阻液(3 g脱脂奶粉+90 mL蒸馏水+10 mL 10×PBS)进行封阻，每孔 100 μ L，并在 37℃条件下培养 1 h。

1.5 加样 微量板用PBS冲洗1次，在封阻液中按1∶100滴度稀释阴、阳性标准血清、被检血清后，每个样品平行加到微量板的两个孔中，每孔50 μ L，并在37℃条件下培养1 h。

1.6 加二抗 用PBS冲洗 6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀释辣根过氧化物酶标记兔抗羊的IgG 抗体(Bethyl Laboratories，USA)，稀释后每孔加 50 μ L，并在 37℃条件下培养 1 h。

1.7 底物 用PBS冲洗6次后，每孔加 100 μ L底物(每1 mL 底物中含有 0.3 μ g ABTS，0.1 mol/L柠檬酸缓冲液pH 4.0和 0.003%H2O2)，在室温阴暗处放置1 h后读数。

1.8 读数 用 Wellscan MK 3酶标仪(Labsystems Dragon，Finland)在 OD415 nm条件下测定光吸收值(OD)。

1.9 判定标准 ELISA滴度表示成最大稀释度的倒数，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GST-SAG1孔和GST孔之间的光密度吸收值是不同的，两孔阴性血清对照孔的平均值必须低于0.1，样品ELISA抗体滴度值等于或大于0.1为阳性，低于0.1为阴性。

2 结果

对所收集的2 402份绵羊血清样品应用所建立的ELISA诊断试剂盒进行血清学诊断，其中：土种绵羊血清 1 392份，检出 25份阳性，阳性率为1.80%；改良绵羊血清786份，检出27份阳性，阳性率为3.44%；小尾寒羊血清224份，检出4份阳性，阳性率为1.79%。表明青海省的绵羊群中存在弓形虫病的感染，见表1。

表1 弓形虫ELISA诊断试剂盒的检测结果

3 讨论

3.1 本次共检验2 402份绵羊血清，检出阳性数56份，阳性率为2.33%。其中：土种绵羊、改良绵羊和小尾寒羊的阳性率分别为 1.80%、3.44%和1.79%，本次调查结果表明，在青海省的绵羊群中存在弓形虫的感染。弓形虫的感染是否存在不同种群的易感性，有待于今后进一步的研究。

3.2 加强弓形虫病的检疫淘汰，加强牧户中猫的管理、搞好环境卫生，力争将弓形虫病的危害降到最低程度。据报道，感染了弓形虫的羊在人类弓形虫病的传播上有特殊作用[4]。因此，做好羊的弓形虫病检测及控制对防止人类弓形虫病的发生有着重要的意义。

3.3 对弓形虫病的治疗药物仍以磺胺类药物和抗菌增效剂联合使用疗效最好。一些新的化疗药物对治疗弓形虫病具有良好的效果，但目前治疗药物的研究主要针对人弓形虫病及小鼠弓形虫病的模型建立，在弓形虫病的治疗方法上进展不大，所以应尽快评价这些药物治疗弓形虫病的效果。

3.4 目前，国内外专家学者已对弓形虫病的流行、病原形态、生活史、诊断和免疫等方面做了大量研究工作，并取得了一定成绩。但用于预防弓形虫病发生的有效生物制剂尚需进一步研究，对其发病机理和动物模型的研究，是为进一步开发诊断试剂和建立有效控制方法的基础。

[1] El Kouni M H.Adenosine metabolism in Toxoplasma gondii：potential targets for chemotherapy[J].CurrPharJ-Teisai Des，2007，13(6)：581-597.

[2] Seng S，Makala L H，Yokoyama M ，et al.SAG1 is a hosttargeted antigen for protection against Toxoplasma gondii infection[J].Pathobiology，2004，71(3)：144-151.

[3] Dzierszinski F，Mortuaire M，Cesbron-Delauw M F，et al.Targeted disruption of the glycosylpho sphatidy linositol-anchored surface antigen SAG3 gene in Toxoplasma gondii decreases host cell adhesion and drastically reduces virulence in mice[J].Mol Microbiol，2000，37(3)：574-582.

[4] 原永海，马利青.小尾寒羊弓形虫病血清抗体检测[J].中国兽医杂志，2007，43(8)：44.