朱晓霞,张勇,罗学刚

（西南科技大学材料科学与工程学院，四川绵阳621010）

天麻多糖的结构表征

朱晓霞,张勇,罗学刚

（西南科技大学材料科学与工程学院，四川绵阳621010）

对分离提纯得到的川产天麻多糖结构进行分析，结果如下：天麻粗多糖重均分子量为4.23×105，分散系数3.66，最大值达到1.38×106u。经HPLC分析，GPSa的分子量为4.97×105u，主要由葡萄糖构成，还含有少量的鼠李糖和甘露糖，其鼠李糖∶甘露糖∶葡萄糖=1∶1.07∶67.24。经红外光谱（IR）、1H和13C核磁共振（NMR）结构分析确定其糖链主要结构为α-(1→4)吡喃型D-葡萄糖。

天麻;多糖;结构

Abstract:Analyzing the structure of the Gastrodia elata BL polysaccharides which produce from SichuanProvince and the results showed those as follow.The weight-average molecular weight of GPS is 4.23×105u,dispersible modulus is 3.66 and the max molecular weight is 1.38×106u.The molecular weight of GPSa is 4.97×105u by analyzed with HPLC.It was made up of glucose,little rhamnose and mannose（the rate is 67.24∶1∶1.07）.Then through IR,1H,13C NMR,the results showed that the main polysaccharide chain was α-(1→4).

Key words：Gastrodia elata BL.;polysaccharides;structure

多糖的结构是其生物活性和功能的基础，认识和了解多糖的结构有助于更好地利用和开发多糖[1]。多糖的化学结构与其生物功能关系密切，与蛋白质相似，多糖也是大分子，结构上可以分成一级、二级、三级和四级结构[2]。多糖的一级结构是指糖基的组成，糖基排列顺序，相邻糖基的连接方式，异头碳构型以及糖链有无分支，分支的位置与长短等。由于多糖结构的复杂性,在多糖一级结构的分析中,往往需要使用多种方式的测试手段获得糖链的一级结构信息，目前国内植物多糖的研究报道较多[3-5]。本文对本实验室分离提纯所得到的天麻多糖GPSa进行凝胶过滤分子量分析、单糖组分分析、红外（IR）和核磁共振（1HNMR和1CNMR）扫描等初步表征。

1 材料和方法

1.1 原料、试剂材料及仪器

生物质化学衍生物四川省高等学校重点实验室分离提纯后所得到的多糖组分；葡聚糖标准品Dextran T-2000，T-500，T-70，T-40，T-10(Pharmacia，瑞典)。

1.2 仪器设备

Waters 2695 Alliance高效液相色谱系统：成都雅源科技有限公司；Empower色谱工作站：美国Waters公司；Shodex OHpak SB-804HQ多糖分析柱：江苏汉邦科技有限公司；Shodex OHpak SB-G保护柱：浙江大学智达信息工程有限公司；Waters 2420 ELS Detector：美国Waters公司；示差检测器：日本Shodex公司。

2 方法

2.1 GPSa理化性质分析

1）物理性质：观察多糖形状、颜色、气味，在水中及有机溶剂中的溶解性及pH值。

2）化学性质：苯酚－硫酸法反应，茚三酮法检测蛋白质，淀粉－KI试纸试验。

2.2 纯度检测

取测试样品GPSa 1 mg溶于1 mL蒸馏水，10000 r/min离心10 min，取上清10 μL上样，记录洗脱曲线用于判定该多糖组分的纯度。

本实验室的HPSEC的具体测试条件如下：

Waters高效液相色谱系统（2695 HPLC Pump，Inline Degasser，2414Refractive Index Detector 与 2487 DualλAbsorbance Detector平行检测，TSK PWXL 4000-3000串联柱）。

流动相为pH为7.0的0.1mol/LNaH2PO3和0.3mol/L NaNO3。

流速为 0.6 mL/min，柱温（30±0.1）℃。

2.3 分子量测定

以不同标准分子量的葡聚糖Detxran-T系列（分子量4000至200万的10个标准品）作对照，用高效液相色谱法测定，由lgMw对tR作图获得标准曲线，然后在相同条件下获得样品层析图谱，通过GPC计算机软件计算分子量。

2.4 单糖组成测定

本文采用气相色谱法，分析时由于样品在气相中传递速度更快，再加上应用毛细管柱、程序升温技术和采用更灵敏的检测器（如氢离子火焰化检测器），使得糖类分离具有选择性强、分辨力好、灵敏度高以及分析速度快等优点。但是由于糖类不容易挥发，必须预先进行衍生化，成为易挥发、对热较稳定的衍生物。在糖进行衍生化这一步骤，由于衍生化不充分，以及生成非目标衍生物的其它副产物，易对分析造成干扰。

2.5 紫外光谱分析

称取样品GPSa 3 mg，用蒸馏水配制成1 mg/mL的溶液，在200 nm～300 nm下进行紫外全扫描。

2.6 红外光谱（Infrared spectroscopy，IR）分析

红外操作：取GPSa2mg充分干燥的组分，与200mg经干燥的KBr粉末在玛瑙研钵中细细研磨均匀，再经压片机压片，上机4000cm-1～400cm-1波长范围内扫描。

2.7 一维核磁共振（NMR）

NMR检测：取50 mg天麻多糖单组分GPSa溶于0.5 mL D2O，在常温下，上机进行分析。

3 结果与讨论

3.1 GPSa理化性质

呈白色粉末状固体，无异味，可溶于水，易溶于热水，不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂，pH值为6.3。苯酚－硫酸反应阳性，茚三酮反应为阴性，说明多糖中无蛋白质存在；此多糖不能使淀粉－KI试纸变兰，说明GPSa为非淀粉多糖。

3.2 分子量确定

3.2.1 标准曲线

取标准葡聚糖 Dextran T-2000、T-500、T-70、T-40、T-10,配制成2%的溶液，12000 r/min离心10 min，上清液用来制作标准曲线，进样量10 μL，标准曲线见图1。

以保留时间tR对标准品Mw的对数值进行线性回归，得回归方程为lgMw=-0.2813×tR+9.693,R2=0.9955，Mw 线性范围为 104u～2×106u。

3.2.2 粗多糖分子量测定

粗多糖的分子量确定：将提取的天麻多糖除蛋白后，冷冻干燥成粉末，送样到中国科学院成都分院分析测试中心测定。结果如表1。

表1 粗多糖分子量Table 1 Molecular weight of wide polysaccharide

常用的平均分子量有以数量为统计权重的数均分子量(Mn)和以重量为统计权重的重均分子量(MW)。天麻粗多糖的分散系数为3.66，说明天麻粗多糖分子量分布特别分散，最大值达到1.38×106u。

3.3 纯度鉴定及GPSa分子量测定

GPSa的HPLC图谱如图2所示，GPSa经高效液相色谱测定其在HPLC中为单一对称峰，表明其为均一组分。由图2可知，组分GPSa的洗脱时间为14.21 min，根据标准曲线可得分子量为4.97×105u。

3.4 单糖组成

图3为标准糖样中单糖的气相色谱图与天麻多糖的气相色谱图。

从GC图谱可知，GPSa主要是由葡萄糖构成，还含有少量的鼠李糖和甘露糖，鼠李糖：甘露糖：葡萄糖=1∶1.07∶67.24。15.886,20.877 两处峰在标准品中未出现，其对应的单糖在样品中含量很小，不影响样品主要组成。

图2 GPSa的HPLC图谱Fig.2 HPLC elution of GPSa

图3 标准糖样中单糖的气相色谱图与天麻多糖的气相色谱图Fig.3 GC of the monosaccharides in standard sample and GPSa

3.5 紫外分析

图4为GPSa紫外扫描图。

对多糖在200 nm～300 nm进行紫外全扫描，结果显示在280 nm和260 nm处都没有吸收峰，说明此均一多糖不含蛋白质和核酸。

3.6 红外光谱分析

图5为GPSa的红外光谱图。

图4 GPSa紫外扫描图Fig.4 The UV scanning curve of GPSa

图5 GPSa的红外光谱图Fig.5 IR spectrum of GPSa

从红外光谱分析，该糖具有多糖特征，多糖的吸收谱带：其在3434 cm-1有强且宽的-OH吸收峰，系多糖上的－OH形成的分子间、内氢键；在2925 cm-1附近的峰为饱和C-H伸缩振动(为-CH、-CH2的吸收峰)信号，中等强度；在1630 cm-1左右的峰是多糖水合振动峰；在1730 cm-1没有糖醛酸的吸收峰；在1300cm-1～1250 cm-1处没有吸收峰，表明无磷酸基取代；1247cm-1处的应为磺酸基的S=O伸缩振动峰；1103cm-1、1080cm-1、1024 cm-1三个峰为吡喃糖环特征吸收峰，是其糖苷键C-O-C的非对称振动峰，吸收很强；红外光谱在890cm-1附近无吸收峰，而在837 cm-1（844±8）cm-1峰范围内，为α构型）处形成峰，表明组成单糖为α－D－葡萄吡喃糖，另外在875 cm-1和810 cm-1处无吸收，表明不含甘露吡喃糖、半乳吡喃糖。

3.7 一维核磁共振

图6和图7分别是天麻多糖单组分GPSa的1HNMR和13CNMR，从谱图中可得出葡聚糖的主要信息。

图6 GPSa的1H核磁共振谱图（30℃）Fig.6 1H NMR spectrum of GPSa at 30℃

在1H谱中，5.44×10-6g/L处有异头碳C1上质子的氢位移，表明这些葡萄糖残基均为α型吡喃糖，这与红外光谱分析一致。在13C谱中，102.466×10-6g/L处化学位移表明C-1发生取代；在87.5×10-6g/L左右没有发生互相位移，表明没有C-3发生取代；在69×10-6g/L处没有化学位移，表明没有发生取代的C6。所以此糖链可能的主链结构为1－4连接。

4 结论

1)单组分GPSa的理化性质：呈白色粉末状固体，无异味，可溶于水，易溶于热水，不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂，pH值为6.3。GPSa不含蛋白质，为非淀粉多糖。

2)天麻粗多糖重均分子量为4.23×105u，分散系数3.66，最大值达到 1.38×106u。经 HPLC 分析，GPSa的分子量为4.97×105u。

3)单组分GPSa经GC分析：GPSa主要是葡萄糖构成，还含有少量的鼠李糖和甘露糖，鼠李糖：甘露糖：葡萄糖=1∶1.07∶67.24。

4)单组分GPSa经红外光谱（IR）、1H和13C核磁共振（NMR）结构分析确定其糖链为α-(1→4)吡喃型D-葡萄糖。

[1]杨世林,兰进,徐锦堂.天麻的研究进展[J].中草药,2000,31(1)：66-69

[2]张宏杰,周建军,李新生.天麻研究进展[J].氨基酸和生物资源,2003,25(1)：17-20

[3]杨云.孟江,冯卫生.大枣酸性多糖ZJ-6的化学研究[J].食品科学,2004,25(5)：55-58

[4]林娟,邱宏端,林霄.甘薯多糖的提取纯化及成分分析[J].中国粮油学报,2003,18(2)：64-66

[5]刘方明,李志孝,孟延发.红芪多糖RHG的分离纯化及化学结构[J].药学学报,1997,32(8)：603-606

Studies on Structure Characterization of Gastrodia Elata BL Polysaccharides

ZHU Xiao-xia，ZHANG Yong，LUO Xue-gang
（School of Material Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，Sichuan,China）

2010-05-10

朱晓霞（1982—），女（汉），助教，硕士，从事天然生物大分子研究。