葡萄柚精油抑菌活性的研究

2010-09-12李悦侯滨滨静宝元

食品研究与开发 2010年11期

关键词：葡萄柚黑曲霉枯草

李悦，侯滨滨，静宝元

（天津渤海职业技术学院，天津300402）

葡萄柚精油抑菌活性的研究

李悦，侯滨滨，静宝元

（天津渤海职业技术学院，天津300402）

采用纸片扩散法、连续稀释法和自然沉降法对葡萄柚精油抗菌活性进行了测定。葡萄柚精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酵母菌的抗菌圈直径分别为（17.2±1.9）、（9.2±0.7）、（27.1±2.3）、（17.2±2.3）、（18.5±1.6）mm；最低抑菌浓度（MIC）分别为 2.00%、10.00%、1.00%、5.00%和 1.00%；对室内空气中菌类的平均抑菌率达44.6%。葡萄柚精油有较强的抑菌活性，是一种很有价值和开发前景的芳香油植物资源。

葡萄柚；精油；抑菌活性

Abstract:To determining the antibacterial activity of the grapefruit essential oil，we used disk diffusion method,serial dilution method and natural sedimentation method.It was found that the diameters of inhibition zone of Escherichia Coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,Aspergillus Nige,Yeast respectively were （17.2±1.9），（9.2±0.7），（27.1±2.3），（17.2±2.3），（18.5±1.6）mm；And the lowest inhibitory concentration（MIC）respectively were：2.00%，10.00%，1.00%，5.00%and 1.00%.Fungi in indoor air,the average inhibitory rate was 44.6%.The result shows that grapefruit essential oil which has quite strong antibacterial activity enjoys a prosperous marketing prospect.

Key words：grapefruit；essential oil；antibacterial activity

葡萄柚，又名西柚，属芸香科，学名为Citrus paradis，英文名为Grapefruit，Pomelo。其风味与甜橙、橘子、柠檬等有很大的差异，从葡萄柚果皮中由水蒸汽蒸馏法取得的挥发性成分，被称作葡萄柚精油。外用深层净化暗疮及充血的肌肤，紧实皮肤与组织，治疗耳聋，强化肝功能，增进食欲，利尿，美白，抗蜂窝组织炎，减肥，增进记忆力，净化思绪，减轻忧郁不安，抗菌。内服可以抗菌（抗病毒）、排毒、解毒、利肝、滋补、利尿、利胆、促消化，改善厌食或药瘾，因此葡萄柚精油已被广泛用于食品及化妆品工业中。国外食用葡萄柚已有多年历史，但是由于该水果价格较高，国内食用并不普遍，对其精油的研究就更鲜有研究。为此，笔者测试了葡萄柚精油对条件致病菌大肠杆菌（Escherichia coli）、病源金黄色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Aspergillus niger）和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的抑菌活性，以及对室内空气微生物的抑菌生物活性，探讨葡萄柚精油在抑菌、抗菌以及食品防腐领域的应用前景，旨在为葡萄柚精油的产业化开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 新鲜葡萄柚果皮

葡萄柚采购于市场，去掉果肉，果皮留用。

1.1.2 试验菌种

试验所用的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉和酵母菌皆由天津渤海职业技术学院生物工程系微生物实验室提供。

1.1.3 固体培养基

1）牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌）：牛肉膏3 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，蒸馏水 500 mL，琼脂 15 g～20 g，调节pH值至7.4~7.6，然后121℃蒸汽灭菌30 min。

2）马铃薯培养基（培养真菌）：取去皮马铃薯20 g，切成小块，在锅中加水500 mL煮沸30 min，用双层纱布过滤，取其滤液，加入蔗糖（或葡萄糖）2 g，加琼脂2 g，用蒸馏水定容到500 mL，pH值自然，121℃蒸汽灭菌30 min。

3）高氏一号培养基（培养放线菌）：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 15 g~20 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.4~7.6，121℃蒸汽灭菌30 min。

1.1.4 液体培养基

在上述制备方法中，不加入琼脂就制成相应的液体培养基。

1.2 主要仪器

BC-500台式离心机：上海中科生物医学高科技开发有限公司；PYX-DHS-50×65-BS隔水式电热恒温培养箱、MJ-180B型霉菌培养箱：上海跃进医疗器械厂；HYG-II回转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；SW-CJ-1D型无菌操作台：苏州净化设备厂；LS-B 50L型杀菌锅：上海医用核子仪器厂；101-2型电热鼓风干燥箱：上海实验仪器制造厂；PL-2002电子天平：Mettler-Toledo公司。

1.3 研究方法

1.3.1 精油的提取与区分

将新鲜无霉变的葡萄柚皮浸在浓度为7%~8%的石灰水中（pH值12以上），浸泡16 h~24 h，期间翻动2次~3次，以浸泡果皮呈黄色，脆而不断为宜。将浸过石灰水的葡萄柚皮用流动清水漂洗干净，捞起沥干。先将葡萄柚皮破碎至3 mm大小，用水压机进行压榨，形成油水混合物。通常加明矾水使之沉淀，用布袋过滤，除去糊状残渣。然后，采用6000 r/min~8000 r/min高速离心机，分离完毕后，停止加料，让离心机转2 min~3 min，冲入大量的清水，把残存油冲出。静置与抽滤。分离出的香精油往往带有少量水分和杂质，应放在5℃～10℃的冷库中静置5 d～7 d，让杂质与水下沉，然后用角虹吸管吸出上层澄清油，通过滤纸或石棉纸滤层的漏斗减压抽滤，所得葡萄柚精油为无色油状液体。

1.3.2 微生物生长曲线的测定

浊度法测定[1]大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌的生长曲线：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在37℃、酵母菌在28℃分别培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h，利用 T6 新世纪紫外可见光分光光度计在波长760 nm处测定大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的OD值，在600 nm处测定酵母菌OD值，绘制供试菌种的生长曲线。黑曲霉生长曲线的测定采用称重法[1]。将供试菌种 28 ℃分别培养 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h后，收集菌体，烘干至恒重，采用精度为0.001 g电子天平称量菌体重量，绘制生长曲线。

1.3.3 菌悬液的配备

根据大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌生长曲线，当其OD值达0.8时，抽取菌液0.5 mL加入无菌水倍比稀释到105cfu/mL~106cfu/mL；抽取OD值为1.2时的酵母菌液，加入无菌水稀释到105cfu/mL用于抑菌活性测定。

黑曲霉菌悬液制备：用10 mL无菌水将长有成熟孢子的斜面上的孢子洗脱到三角瓶，加入100 mL液体培养基和玻璃珠，在摇床（200 r/min）上培养18 h后，用经灭菌的脱脂棉过滤2次，将滤液放在振荡器上混匀，加入无菌水对倍稀释，镜检制成107cfu/mL~108cfu/mL单孢悬液，用于抑菌活性测定。

1.3.4 抑菌圈直径

采用纸片扩散法[2]。用打孔器将滤纸制成直径为6 mm的小圆纸片，干热灭菌后，备用。在灭菌的培养皿（D＝90 mm）内加入相应菌种的固体培养基15 mL~20 mL，制成营养平板，抽取供试菌悬液各100 μL到相应菌种的培养平板上，涂抹均匀。然后在每个营养平板中均匀、平展放入3片滤纸片，在其中2片上分别滴加葡萄柚精油20 μL剩余1片滤纸片加20 μL无菌水作对照。在37℃培养箱恒温培养24 h后，测定大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌抑菌圈直径，在28℃培养箱内恒温培养48 h后，测定黑曲霉、酵母菌抑菌圈直径。重复试验3次。

1.3.5 最小抑菌浓度（MIC）

采用连续稀释法[3]。以丙酮为溶剂，配制一系列梯度浓度的精油溶液，将该梯度浓度的精油溶液加入已融化好的培养基中，混合均匀，使培养基中含精油的浓度为10.00%、7.50%、5.00%、2.00%、1.00%、0.500%、0.250%。待培养基冷却凝固后，平板划线接种供试菌，按前述条件培养，观察结果，每一精油浓度梯度作3组平行试验，与对照组（菌落生长正常）比较，有肉眼可见菌落生长者为无抑制作用，以完全没有菌落生长的最低精油浓度为其最低抑菌浓度（MIC，the mini－mum inhibitory concentration），以丙酮、无菌蒸馏水作对照，分别测得葡萄柚精油对5种试验菌的MIC值。

1.3.6 室内空气抑菌率

采用自然沉降法测定[4-5]。将灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯蔗糖培养、高氏一号培养基倾注在9 cm培养皿中冷却备用。将长40 cm宽36 cm高35 cm的测试箱在紫外光下灭菌20 min，放置在距地面1.3 m的平台上。然后将上述制备好培养基的培养皿放入测试箱的底部，打开培养皿上盖，盖好测试箱，通过特制的喷洒口向测试箱内喷洒100 μL葡萄柚精油，使精油雾化均匀，不要使精油直接喷在培养基上，然后迅速密闭喷洒口，在室温（24℃左右）下20 min后打开测试箱盖，盖上皿盖，贴上标签。牛肉膏蛋白胨培养基置于37℃恒温箱中培养24 h，马铃薯蔗糖培养基置于28℃恒温箱中培养48 h，高氏一号培养基于28℃恒温箱中培养72 h，记录各皿菌落，计算单位体积抑菌率。以未加精油自然沉降菌落数为对照。

采用公式Y=[DS-CS]/DY×100%计算抑菌率，式中：Y为抑菌率；DS为对菌落数；CS为精油处理菌落数。

2 结果与分析

2.1 几种菌种生长曲线

试验结果表明：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌生长曲线（图1）和黑曲霉生长曲线（图2）均呈“S”形。3种细菌的对数生长期：金黄色葡萄球菌为4 h~16 h，大肠杆菌为4 h~14 h；枯草芽孢杆菌为8 h~24 h。在生长速度上，金黄色葡萄球菌最快，大肠杆菌居中，枯草芽孢杆菌最慢。OD值达0.8时，3种细菌所需的时间也不一致，金黄色葡萄球菌需要培养7h~8h；大肠杆菌需要8h~9h；枯草芽孢杆菌需要13h~14 h（图1）。酵母菌0~14 h为延滞期，14 h~26 h为对数生长期，26 h后生长开始衰退。培养对数生长期中，当OD值达1.2时需要22 h（图1）。黑曲霉0~8 h为延滞期，16 h~36 h为对数生长期，32 h后生长开始衰退（图2）。以培养20 h时的菌液作为供试菌液。

2.2 葡萄柚精油的抑菌圈直径大小

葡萄柚精油对试验用的5种菌种均有很好的抑菌性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酵母菌的抑菌圈直径分别为（17.2±1.9）、（9.2±0.7）、（27.1±2.3）、（17.2±2.3）、（18.5±1.6）mm；无菌水对照均为6 mm。其中对枯草芽孢杆菌的抗性最强，对金黄色葡萄球菌的抗性最弱。对试验菌种形成的抑菌圈直径大小因菌种而异。根据抑菌圈试验判定标准：即抑菌圈径大于20 mm为极敏；15 mm~20 mm为高敏；10mm~15mm为中敏；7mm~9mm为低敏，小于7mm为不敏感。葡萄柚精油对大肠杆菌、黑曲霉、酵母菌的抑菌程度为高敏；对枯草芽孢杆菌为极敏；对金黄色葡萄球菌为低敏。

2.3 葡萄柚精油对不同菌种的最小抑菌浓度

葡萄柚精油对于枯草芽孢杆菌的抗性最强，当达到1.00%时试管中已没有菌落被检测出来；其次是大肠杆菌，葡萄柚精油对它的最低抑制浓度为2.00%；黑曲霉的最低抑制浓度为5.000%；对于金黄色葡萄球菌的抗菌性相对最弱，最低抑制浓度为7.500%。

表1 葡萄柚精油对细菌的最低抑菌浓度Table 1 MIC of essential oil of Yuzu peel oil on Mycorrhizal specie

2.4 葡萄柚精油对空气中微生物的抑制能力

精油作用20 min，Φ90 cm平皿上自然沉降的落数和对照菌落数,100 μL葡萄柚精油作用于长40 cm宽36 cm高35 cm的测试箱中，经20 min后，将平皿37℃24 h和28℃48 h培养。牛肉膏蛋白胨培养基上沉降的对照菌落数为55.2 cfu，处理菌落数30.2 cfu，抑菌率为41.2%。马铃薯培养基的真菌对照菌落数为30 cfu，处理菌落数15.7 cfu，抑菌率为47.7%。高氏一号培养基上的放线菌菌落数对照为19.3 cfu，处理菌落数11.0 cfu，抑菌率为44.9%。100 μL精油作用于0.05 m3体积的室内空气中，使沉降在平皿上的总菌落数由150.3 cfu减少到59.7 cfu，平均抑菌率为44.6%。