吴子健，陶琳

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

核黄素结合蛋白的性质及其功能

吴子健，陶琳

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

来自鸡的包括鸡蛋的核黄素结合蛋白是单亚基磷酸糖蛋白，能特异性地结合VB2并将其输送到胚胎，以维持胚胎的生长发育。介绍它的种类、分子的组成与结构、结合核黄素的分子机理、分子的热稳定性、对盐酸胍的化学稳定性以及生物学方面的功能。

核黄素结合蛋白；结合核黄素的分子机理；分子结构

Abstract:Riboflavin-binding protein,a globular monomeric phosphoglycoprotein originated from chicken,is able to specific bind and transport riboflavin to the embryo,sustaining its growth and development until hatching.It is to introduce the categories,composition and structure,molecular riboflavin-binding mechanism,thermal stability,chemical stability under the existence of GdnHCl,and its biological functions.

Key words：riboflavin-binding protein;molecular riboflavin-binding mechanism;molecular structure

鸡卵中核黄素结合蛋白（Riboflavin-binding Protein，RfBP），也称为黄素蛋白或卵黄素蛋白，是分子量约为29.2 ku的球状单亚基磷酸糖蛋白，对核黄素（即VB2）具有高度亲和力[1]。鸡蛋清的浅黄色正是由于该种蛋白特异性结合核黄素导致的[2]。其含量占整个蛋清蛋白的0.8%，并且在蛋黄和产蛋母鸡的血浆中也发现了该种蛋白[3]。RfBP蛋白能储存水溶性的VB2并将其输送到胚胎，用以维持胚胎的生长发育直到孵化。目前，关于核黄素结合蛋白的研究国内刚刚开始，综述国内外研究现状，介绍该蛋白分子的性质。

1 核黄素结合蛋白的种类

鸡核黄素结合蛋白分为3种，即蛋清核黄素结合蛋白（Egg-white Riboflavin-binding Protein,wRfBP）、蛋黄核黄素结合蛋白（Egg-yolk Riboflavin-binding Protein，yRfBP）和鸡血清核黄素结合蛋白（Serum Riboflavin-binding Protein,sRfBP）。3种蛋白氨基酸序列都是由同一基因编码的，只是经历了不同的翻译后修饰[2]。wRfBP由输卵管细胞合成[4]；sRfBP是由鸡的肝脏受雌激素控制下合成的；而yRfBP则是蛋白酶将通过卵母细胞膜的血浆核黄素结合蛋白上末端11个～13个氨基酸残基酶解掉形成的[5]。wRfBP蛋白和sRfBP蛋白拥有同样的氨基酸残基序列，不同的是Asn36和Asn147位点的糖基是不同的；目前已知sRfBP蛋白和yRfBP蛋白的糖基一级结构是相同的[6]，而wRfBP蛋白目前只知道其糖基的组成，但糖基一级结构至今鲜见研究报道。

2 核黄素结合蛋白的组成与结构

WRBP蛋白由219个氨基酸残基组成[7]，其N-端为焦谷氨酰残基。在翻译后修饰过程中，该蛋白分子内的8个丝氨酸残基被磷酸化，2个天冬氨酸残基被糖基化。1997年，Monaco报道了其高分辨率X-射线晶体结构[1]，明确表明：分子内约30%氨基酸残基参与形成6个α-螺旋（分别被命名为A到F）；约15%氨基酸残基参与形成了4个β-折叠（分别被命名为a到d）；在这些二级结构中，4个α-螺旋（A到D）和4个β-折叠参与构建了蛋白中高亲和力的核黄素结合位点，而剩余的2个α-螺旋则围绕着186位至197位氨基酸残基形成的可折叠的高度磷酸化区域。WRBP蛋白分子的空间大小约为50×40×35 A˚（如图1和图2所示）。

整个结构可分为2个区域：（1）一个配基结合区域（N-末端至Cys169），该区域较大，且含有一个宽度约为20 A˚、深度为15 A˚的裂缝，可容纳与之结合的核黄素；（2）较小的磷酸化motif（从Cys169到C-末端），含有很多带负电荷的氨基酸残基（8个磷酸丝氨酸残基和10个谷氨酰基残基）[8]，这些磷酸丝氨酸残基高度密集形成群簇，如：Ser185-Glu-Ser（P）-Ser（P）-Glu-Glu190-Ser（P）-Ser（P）-Ser（P）-Met-Ser（P）195-Ser（P）-Ser（P）-Ser（P）-Glu-Glu200[9]。该区域是3种RfBP蛋白都含有的区域，现在已知这个磷酸化区域参与了卵母细胞对PRBP蛋白的吸收，它在PRBP蛋白与卵黄生成素（vitellogenin）相互作用中起到了关键的作用。

这3种RfBP蛋白另一个特点是分子中都含18个半胱氨酸残基（其中9个半胱氨酸残基位于无规则卷曲，7个位于α-螺旋上，2个位于β-折叠上），共形成9个二硫键（如表1所示），稳定着该蛋白天然的结构[11]，其中8个二硫键位于核黄素的结合区域，剩下的一个则是负责连接两个结构域。这些二硫键在空间上与核黄素之间的相对位置如图2所示。

表1 鸡卵清RfBP蛋白中的二硫键[12]Table 1 Disulfide bridges of chicken riboflavin-binding protein

RfBP蛋白中有组成中有14%为糖，分布在2个N-糖基化位点上（即，Asn-36和Asn-147，如图1所示），主要是岩藻糖，甘露糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺和唾液酸，这2个糖基化位点的周围5个残基具有保守性序列（4个为相同氨基酸残基）；但2个位点的糖基化方式（即类型与分布）却不同：一般在Asn-147位点结合的糖具有3到5个支链[13]，而Asn-36位点上糖链较Asn-147位点的分支少。说明蛋白质局部二级、三级结构或糖基化的次序会影响糖基化位点上结合的寡糖结构（Rohrer and White III 1992）。另一方面wRfBP蛋白结合的寡糖不同于yRfBP分子结合的寡糖，是由于这两种核黄素结合蛋白是由不同组织合成，且具有不同的功能。

3 RfBP与核黄素的结合

3.1 核黄素结合位点

核黄素与脱辅基RfBP蛋白按照1∶1的比例强烈结合[14]，其解离常数大约为1.3×10-9M。核黄素由核糖醇链和异咯嗪环组成，其中异咯嗪环（赋予蛋清淡黄色）具有两性性质：二甲苯部分具有疏水性，嘧啶基团部分具亲水性[15]。可见光和紫外线的照射会导致核黄素单体转变为光黄素，特别是在碱性的溶液中，但一旦与蛋白质结合，核黄素可在长期激光脉冲的照射下保持稳定[16]。RfBP蛋白的核黄素结合区域是一个约20 A˚宽15A˚深的憎水性裂口，含有蛋白质中5/6的丝氨酸残基。核黄素上异咯嗪环与Trp-156和Tyr-75的芳香环平面相互平行堆积在一起。图3清楚地显示了核黄素分子以及与其结合接触的氨基酸残基侧链的电子密度。

并且在RfBP蛋白与核黄素结合时，异咯嗪环中憎水性的二甲苯部分深入蛋白的内部。核黄素中的异咯嗪与蛋白间的相互作用主要为憎水相互作用。

3.2 二硫键对RfBP结合核黄素的影响

1981年Kozik A[17]利用巯基乙醇或二硫苏糖醇的还原作用将脱辅基的蛋清RfBP分子中的所有二硫键断开，结果发现蛋清RfBP分子丧失了结合核黄素的能力，并且其动力学和统计分析表明该蛋白分子内的任何一个二硫键对于蛋白结合核黄素都是至关重要的。同时该项研究也表明结合了维生素的核黄素结合蛋白复合体中的二硫键较难以被还原断开，但若被还原，反应呈现一级反应的规律。

3.3 RfBP中寡糖对RfBP结合核黄素的影响

1981年Miller等在温和条件下酸解和乳糖氧化酶去除RfBP中的唾液酸，利用来自黑曲霉的各种糖苷酶混合物去除RfBP中的N-乙酰氨基葡糖和乳糖，然后对比研究发现去除了糖基的RfBP分子对于核黄素结合的能力低于天然分子的能力。说明去除糖链会致使其与核黄素集合能力的下降。

3.4 pH值对RfBP结合核黄素的影响

pH值对于RfBP与核黄素的结合影响较大：通常pH值在4.5与9之间，核黄素与蛋白质结合紧密；但当pH低于4.0时，两者的结合常数会迅速下降：核黄素与RfBP解离，形成脱辅基蛋白与游离的核黄素[18]。当pH＞4.5时，核黄素结合位点构象是固定的,但pH＜4.0时，圆二色谱法检测表明其芳香族氨基酸侧链的迁移率，分子体积，分子表面，蛋白质的水化作用均有显著的变化，同时各向异性也会降低。酸性pH值可诱导的核黄素结合位点的酪氨酸和色氨酸芳香环重新定向，从而导致蛋白中富含芳香族氨基酸残基的裂口部位张开并释放核黄素。在pH值较低时，提高RfBP蛋白溶液的离子强度会显著增加解离常数，但是在中性pH值时，却不会。

4 RfBP的稳定性

4.1 RfBP分子的热稳定性

2000年Marcin Wasylewski利用示差扫描量热法技术测定了蛋清RfBP分子热力学折叠的各种参数，考察了含辅基的RfBP分子以及不含辅基的RfBP分子的热变性参数，发现[19]：RfBP蛋白的热稳定性高，不含辅基的RfBP分子的变性温度为60.8℃，且结合核黄素会增强其热稳定性，变性温度可直接提高到72.8℃。在2004年Marcin Wasylewski进一步研究证明[20]：蛋白分子中的9个二硫键会使RfBP分子形成紧凑的结构，并且使其分子热变性过程可逆，通常其热变性过程分为2个独立的进程，而这一特点与该蛋白中存在2个独立的结构区域（N-端核黄素结合区域、C-端磷酸化区域）有关，在被加热时，2个结构区域会依次打开折叠而伸展；N-端核黄素结合区域比C-端磷酸化区域的变性温度要低；同时配基结合会大大提高N-端区域的热稳定性，而对C-端区域的热稳定性影响轻微。

4.2 化学变性

若利用盐酸胍对RfBP进行化学变性，当盐酸胍的浓度从0 mol/L变化到6 mol/L时，天然RfBP有两个打开分子重叠而伸展的阶段[21]。当盐酸胍浓度从0 mol/L到2 mol/L时，RfBP蛋白失去一些三级结构，在盐酸胍浓度在2 mol/L到4 mol/L时，RfBP蛋白分子成为稳定的中间态，当盐酸胍浓度在4 mol/L到6 mol/L时，该蛋白分子完全变性并且失去其二级结构。由于憎水性裂口的坍塌，当盐酸胍浓度为3 mol/L时，所有的核黄素分子都会从蛋白的分子上解离下来（Zhong and Zewail 2001）。只要9个二硫键存在，在变性剂去除后，变性的RfBP蛋白会很快重新折叠。如果RfBP蛋白事先被还原过，正确的二硫键不会立即重新形成，该蛋白也就会丧失其结合核黄素的能力[22]。

5 RfBP蛋白的功能

5.1 输送VB2供鸡胚胎发育[1]

RfBP蛋白最主要的生物学功能是储存水溶性的VB2并将其输送到胚胎，以维持胚胎的生长发育直到孵化。禽蛋中RfBP的量在其他营养载体蛋白中是相对充足的，因为核黄素对于胚胎的正常发育至关重要。1992年White III HB等研究表明：缺乏RfBP的产蛋母鸡所下的受精蛋是无法成为能够存活的胚胎，缺乏核黄素的鸡蛋形成的胚胎会在孵育约13 d左右而死亡。这主要是由于在孵化13 d时，恰逢黄素激酶活性大大增加，这是一种利用核黄素合成FMN、FAD的酶。

5.2 抗菌作用[23]

RfBP在蛋清中可以充当核黄素的吞噬者，可消除游离的核黄素，从而抑制需要利用核黄素作为营养的微生物的生长，从而保护鸡胚胎不受细菌侵害。

5.3 选择性的甜味抑制剂和苦味抑制剂[24-25]

2007年Kenji Maehas等的研究表明蛋清RfBP分子可以选择性地抑制蛋白类甜味剂的甜味，诸如：竹芋蛋白、莫尼糖蛋白和溶菌酶等，但是无法抑制小分子的甜味剂的甜度，诸如：蔗糖、甘氨酸、D-苯丙氨酸、糊精、环氨酸盐、阿斯巴甜和甜菊糖等。2008年该研究组还揭示：蛋清RfBP还可以作为苦味抑制剂，抑制诸如：盐酸喹啉、柚（皮）苷、可可碱、咖啡因、Gly-Phe和苯甲地那铵等物质的苦味。因此RfBP蛋白也许可用于降低食品或药物的苦味。

6 展望

目前人们对于蛋清RfBP蛋白结构与功能、其与核黄素结合过程关系等有了较为深入的了解，特别是其可选择性地抑制蛋白类甜味剂的甜味并抑制苦味，该蛋白可有助于揭示甜味蛋白物质、苦味物质结构与活性之间的关系以及人类甜味和苦味感知的机理。

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Properties and Functions of Riboflavin-binding Protein Originated from Chicken

WU Zi-jian,TAO Lin
（School of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology,Tianjin 300134,China）

2010-06-11

吴子健（1973—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：生物活性物质提取与应用。