徐贵华，张凤梅，张磊

（1.河南科技学院食品学院河南新乡453003；2.河南科技学院外语系河南新乡453003）

果蔬食品体外抗氧化方法研究进展

徐贵华1，张凤梅2，张磊1

（1.河南科技学院食品学院河南新乡453003；2.河南科技学院外语系河南新乡453003）

食用果蔬食品可以有效降低多种疾病的发生率，抗氧化能力是重要原因。抗氧化物质清除自由基的机制主要有氢原子转移（HAT）和单电子转移（SET）2种。本文具体介绍了ORAC法、TRAP法、PCL化学发光法、β-胡萝卜素亚油酸体系、LDL低密度脂蛋白氧化方法、福林酚法、ABTS清除自由法、DPPH清除自由基法、FRAP法。并结合实例介绍果蔬食品体外抗氧化方法研究进展，对抗氧化方法的标准化进行了展望。

果蔬食品；抗氧化；氢原子转移；单电子转移

Abstract:Consumption of fruits and vegetables has been related with a lowered incidence of degenerative diseases.The positive influence of such diet is attributed to antioxidant capacity in them.Antioxidants can deactivate radicals by two major mechanisms,hydrogen atom transfer（HAT）and single electron transfer（SET）.Nine frequently used methods were introduced,namely：ORAC （oxygen radical absorbance capacity）,TRAP（total radical-trapping antioxidant parameter）,PCL（photochemiluminescence）,β-carotene bleaching method,low-density lipoprotein（LDL）oxidation,Folin-Ciocalte Assay,ABTS（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate））,DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical）and FRAP（ferric reducing antioxidant power）.The recent development of antioxidant assays in vitro of vegetables and fruits were presented with instances,and the prospect of standardizing the antioxidant methods was made.

Key words：fruits and vegetables；antioxidant；hydrogen atom transfer；single electron transfer

越来越多的证据显示食用水果蔬菜可以有效降低多种疾病的发生率，如心血管疾病、癌症、免疫力下降等[1-2]。果蔬食品的上述功能主要归因于其富含的多种维生素如VC、VE、胡萝卜素、酚类物质等。这些天然产物具备自由基清除能力，从而避免了生物细胞受到氧化损伤[3]。果蔬食品体外抗氧化研究成为国际上研究的热点之一，基于不同的机理出现了众多的抗氧化方法，国内对果蔬食品抗氧化功能研究也方兴未艾，本文主要就国外常用抗氧化方法做一定综述。

1 果蔬食品体外抗氧化方法分类

目前用于体外测定果蔬食品抗氧化能力的方法从测定手段来划分有：比色法、化学发光法、荧光法、电子自旋共振法（ESR）等。按抗氧化反应机理可划分为：氢原子转移（HAT：Hydrogen Atom Transfer）和单电子转移（SET：Single Electron Transfer）。常用抗氧化方法主要有以下几种：ORAC（oxygen radical absorbance capacity）氧自由基吸收能力、TRAP（total radical-trapping antioxidant parameter）法、PCL（photochemiluminescence）化学发光法、β-carotene bleaching method（β-胡萝卜素亚油酸体系）、low-density lipoprotein（LDL）oxidation（低密度脂蛋白氧化反应）、Folin-Ciocalte Assay（福林酚法）、ABTS（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）） 法、DPPH （2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical）法 、FRAP（ferric reducing antioxidant power）法等。抗氧化能力强弱的表达方式主要有TEAC（Trolox equivalent antioxidant capacity）、抑制率、IC50（半抑制浓度）、AE（抗氧化效率）等，目前尚没有标准化的食品体外抗氧化方法[4-5]。不同的抗氧化方法基于不同的反应机理取得的结果总是不尽相同的，所以有必要采取多种抗氧化方法来评价抗氧化能力，以期获得较客观的抗氧化能力评价，本文结合实例介绍了国外近年来抗氧化方法研究进展。

2 常用果蔬食品体外抗氧化方法机理及应用

抗氧化剂清除自由基的机制主要有HAT和SET 2种。虽然机制不同，但结果是一样的。HAT反映的是抗氧化剂以供氢的方式清除自由基的能力：X·+AH→XH+A·。SET反映的是抗氧化剂以转移电子来清除某种物质的能力：包括金属、自由基等：X·+AH→X-+A·+；M（III）+AH→AH++M（II）。

2.1 基于HAT反应机制的抗氧化试验方法

2.1.1 ORAC法

ORAC法最先由Ghiselli提出[6]，ORAC测定的是由氢过氧自由基所引发的氧化反应。在ORAC体系中，过氧化氢自由基与荧光物质反应生成非荧光产物，通过记录荧光值的减少来计算抗氧化物质对自由基的抑制能力。通常使用荧光蛋白B-phycoerythrin(B-PE)、fluorescein或dichlorofluorescein作为荧光探针（fluorescent probe）。

应用举例[7]：以 Trolox（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，水溶性维生素E）为标样，在37℃，pH 7.4条件下与荧光物质B-PE混和，加入氧化剂 AAPH （2，2’－azobis（2－amidinopropane）HCl），设置分析仪开始记录荧光值（激发波长485 nm，发射波长525 nm），每分钟记录1次，共测35 min。随反应的进行B-PE减少而荧光减弱，荧光物质测定值以初始值的相对值表示，结果用样品荧光面积减去空白（未加抗氧化物质）荧光面积的净面积来表示，如图1所示。用Trolox作标准曲线，μmTrolox/g当量来表示抗氧化能力。

特点：ORAC法模拟了抗氧化剂清除食品体系中油脂氧化产生自由基的过程，可适用于亲水与疏水抗氧化体系。ORAC法可以设计为自动完成，但反应对温度敏感，试验过程中应严格控制温度。ORAC法不足之处是分析时间较长。在国外ORAC法是一种较为公认的抗氧化方法，许多不同果蔬产品间的抗氧化能力比较就是采用的这种方法，目前国内少有采用ORAC法的报导。

2.1.2 TRAP法

与ORAC法类似的反应机理，TRAP法采用R-phycoerthrin作为荧光探针。用氧化剂AAPH或ABAP[2,2-azobis（2－amidinopropane）dihydrochloride]产生氢过氧自由基。在抗氧化物质加入后，荧光值的减弱将延迟，以延迟时间与加入Trolox（标样）量作标准曲线，结果见图2。

应用举例[8]：1.5×10-8mol/LR-PE 溶于 75 mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液，加入待测样品使终体积为2 mL,37℃下于1 cm的石英荧光比色皿放置5 min，加入ABAP（使终浓度为4 mmol/L）引发氧化反应，测定RPE荧光的减少，每5 min测一次，至90 min，激发波长495 nm,发射波长575 nm，以Trolox为标样作标准曲线。

特点：TRAP法最常用于体内血清与血浆抗氧化能力的测定，因为它测定的是非酶抗氧化物质，如抗坏血酸、生育酚、β-胡萝卜素、谷胱甘肽等。缺点是重复性差、费时、操作复杂。

2.1.3 PCL化学发光法

通常采用既是发光剂又是自由基检测剂的luminol来检测自由基，国外已有商品化的PCL试剂盒。反应体系产生的超氧自由基与luminol反应而发光，用微弱发光仪计录发光值，在抗氧化物质存在下发光时间会延迟，从而可建立标样（如抗坏血酸）与发光延迟时间的标准曲线，通过测定样品使发光延迟的时间而计算出其抗坏血酸当量。

应用举例[9]：采用Photochem公司（德国柏林）的试剂盒，1.5 mL的试剂1（样品溶剂），1.5 mL的试剂2（反应缓冲液），25 μL 稀释的试剂 3（luminol），10 μL 试剂4（抗坏血酸）或样品溶液。以发光延迟时间（秒）和抗坏血酸浓度(0.05 mmol/L~0.3 mmol/L)为坐标建标准曲线，以样品延迟发光时间计算出抗坏血酸当量。

特点：可以有效测定抗氧化剂清除超氧自由基的能力，可用于亲水和疏水条件，但每次只能测一个样品。有试验表明，PCL的测定结果与ORAC测定结果的相关性很小，可能是因为它们反映的是抗氧化物质对完全不同来源的自由基清除能力。

2.1.4 β-胡萝卜素亚油酸体系

基于乳化体系中亚油酸自氧化产生自由基而使体系中的β-胡萝卜素褪色，在抗氧化物质存在下可延迟褪色。记录体系随时间而变化的吸光值，用抑制率来表示抗氧化能力。

应用举例[10]：2 mg β胡萝卜素溶于10 mL氯仿，取1 mL β-胡萝卜素溶液与20 mg纯化的亚油酸及200 mg吐温40混和，旋转蒸发除去氯仿。加入50 mL蒸馏水超声混和均匀，样品（2 mg/mL）或对照抗氧化剂（BHA、BHT等）加入到5 mL β胡萝卜素/亚油酸体系中，空白用0.2 mL水和5 mL β胡萝卜素/亚油酸乳化液。样品加入后，立即在470 nm下记录吸光值，密封比色管，并置于50℃水浴中，每15 min测一次吸光值至120 min，另一份乳化液不加β胡萝卜素，其余操作同上，用于分光光度计调零，测定结果如图3所示。

特点：属于直接抗氧化方法，以亚油酸自氧化模拟生物体内自由基的产生，区别于DPPH、ABTS等非天然的大分子自由基。但只能用抑制率一种方式来表达抗氧化能力，且试验可重复性较差。

2.1.5 LDL氧化法

从新鲜血样中分离LDL，用Cu2+或AAPH引发氧化反应，随后在234 nm下测定共轭二烯(conjugated dienes)或测定油脂过氧化物含量。

应用举例[11]：采集新鲜血样于试管，加入抗凝结剂，40°C超离心分离LDL，然后将LDL溶于0.4 mL pH 7.4的PBS缓冲液，使最终浓度为100 μg/mL，用10 μmol/L的AAPH或Cu2+引发氧化反应，加入5 μL的甲醇提取物。LDL样品在37°C培养箱下放置60 min，用1 mmol/L EDTA和10 μmol/L的BHT结束反应，加入内标（1 nmoL共轭二烯脂肪酸酯），然后与500 μL乙醇混和，用2 mL正己烷提取，收集正己烷相，挥发至干后溶于100 μL异丙醇，HPLC测定胆固醇亚油酸过氧化物（chol-18∶2-OOH）。HPLC 条件：C18反相柱，测定波长234 nm，流动相为50%异丙酮、40%乙腈和溶有0.1%乙酸铵的10%甲醇，流速1 mL/min。内标通过共轭二烯亚油酸与饱和脂肪酸（C20∶0） 反应来制备，Chol-18∶2-OOH 的制备是由 1 mg胆固醇亚油酸酯/mL(溶于正己烷)在37°C条件下密封放置48 h自动氧化来完成。

特点：试验显示采用AAPH作氧化剂的LDL氧化法与ORAC法有良好相关性，而采用Cu2+却没有。LDL法一个重要不足是它必须从不同个体获得血样，从而难以成为可重复的抗氧化方法。

2.2 基于SET反应机制的抗氧化实验方法

2.2.1 福林酚法

福林酚法最早用于测定蛋白质中色氨酸（含有一个酚羟基）含量，后来广泛用于测定总酚含量，本质上是氧化还原反应。

应用举例[12]：1 mL适当稀释的样品或绿原酸标样加入到装有9 mL蒸馏水的25 mL比色管，加入1 mL福林酚试剂混和均匀，5 min后，加入10 mL 7%Na2CO3后立即加蒸馏水稀释至25 mL并混匀，23°C下放置90 min，然后750 nm下测定吸光值，总酚含量以绿原酸当量表示(mg/100 g)。

特点：对植物来源样品总酚的测定简单而有效，但容易受到糖、VC、有机酸等物质的干扰，与ORAC、ABTS、DPPH等其它抗氧化方法测定结果通常有较好的相关性。

2.2.2 ABTS法

ABTS（分子结构如图4所示），产生ABTS+的方法有多种，一种较常用且简单的方法是：用氧化剂AAPH或过硫酸钾氧化ABTS成蓝绿色的自由基形式ABTS+，通过测定抗氧化物质与ABTS+反应而颜色变浅反映清除自由基能力，以TEAC表示抗氧化能力。

应用举例[13]：ABTS（7 mmol/L）与过硫酸钾（最终浓度：2.42 mmol/L）混和室温避光放置 12 h～16 h，以产生蓝绿色的ABTS·+。试验前，用乙醇将ABTS+溶液稀释至734 nm 下吸光值 0.70（±0.02），100 μL 样品与 1 mL ABTS·+混和30 s后放置6 min，然后测定吸光值，以Trolox（20 μmol/L～200 μmol/L）建标准曲线，样品抗氧化能力以TEAC表示。

特点：简单快速、pH适用范围宽、可用于亲水和疏水体系，并能实现自动化完成。但ABTS阳离子自由基并非生物体所产生，而且不能反映不同抗氧化物质反应速度的差异，在设定的时间内反应可能并未完成，对测定结果造成较大误差。

2.2.3 DPPH法

DPPH（分子结构如图5所示）是一种稳定的深紫色自由基，不必象ABTS+需要事先反应产生。通过测定抗氧化物质与DPPH反应而颜色变浅来反映清除自由基能力，常以半抑制浓度（EC50）或TEAC表示抗氧化能力。

应用举例[14]：取50 μL提取液与5 mL 0.1mmol/L DPPH甲醇溶液混合振荡，于27°C放置20 min，不加提取液作空白，甲醇试剂用于调零，517 nm下测定吸光值（OD），以抑制率表达自由基清除能力。抑制率=[(空白 OD-样品 OD)/空白 OD]×100%。

特点：简单快速，但如果反应体系中存在515 nm下有吸收的物质（如胡萝卜素），结果就会被干扰，另外不能反映不同抗氧化物质反应速度的差异。

2.2.4 FRAP法

FRAP最先用于测定血清的还原力，随后用于植物来源抗氧化物质的分析。它通过测定抗氧化物质还原 Fe3+-TPTZ（2,4,6-trypyridyl-s-triazine）为 Fe2+-TPTZ（如图6所示）的能力来反映抗氧化能力。

应用举例[9]：FRAP试剂制备：醋酸缓冲液（300 mmol/L,pH3.6），与溶于 40 mmol/L HCl的10 mmol/L TPTZ 和 20 mmol/L FeCl3以体积比 10∶1∶1混和。标样溶于水或甲醇，300 μLFRAP试剂与10 μL的标样或样品混和均匀，立即在593 nm下测吸光值，每分钟测1次至4 min，样品FRAP值以抗坏血酸当量计算。

特点：简单快速，不需要特殊设备，可以设计为自动化完成。与DPPH和ABTS法类似，FRAP法也不能反映不同抗氧化物质反应速度的差异。

3 果蔬食品体外抗氧化方法比较及其标准化展望

基于ET反应机制的福林酚法、DPPH法、ABTS法、FRAP法分析结果通常有良好的线性关系，因为它们都是基于类似的氧化还原反应，所以同时使用多种ET反应机制的抗氧化方法是没有必要的。VE保护食品或细胞不饱和脂肪酸不被氧化的机制是HAT机制，氢过氧自由基（peroxyl radical）是食品与生物系统中脂肪氧化的重要因素，在ORAC等HAT反应机制的分析中，研究抗氧化物质抑制氢过氧自由基的过程，可以提供有用的自由基链反应的信息。HAT反应机制的ORAC、TRAP、β-胡萝卜素亚油酸体系的分析方法是基于自由基链反应的，因此更接近食品或生物体真实氧化情况，但它们试验周期长，不适合于天然产物的批量测定。而基于ET反应机制的分析方法如DPPH和ABTS等使用虽然简单方便，但它们所提供的信息是天然产物对某种稳定的大自由基如DPPH、ABTS的清除能力，而不能反映天然产物对氧化过程的抑制作用。另外它们同样有重复性差的不足，主要原因是具体试验条件的选择不同造成的，如试剂浓度、反应时间等，但这些可以通过方法的标准化来实现。事实上任何一种抗氧化方法都不能反映真正的抗氧化能力，所以在选择试验方案时，应尽量选择基于不同反应机制的抗氧化方法，从而获得天然产物较客观的抗氧化能力评价。

目前，抗氧化方法仍未实现标准化，不同实验室的分析报告结果难以进行统一比较。最有可能实现标准化的抗氧化方法是ORAC法、福林酚法和ABTS法[4]。属HAT机制的ORAC法可以反映生物体相关抗氧化机理，属SET机制的ABTS法可反映抗氧化物质清除自由基的能力，而福林酚法是最简单有效、省时省力，适用于大量分析样品的方法。

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Development of Antioxidant Assays in Vitro of Fruits and Vegetables

XU Gui-hua1,ZHANG Feng-mei2,ZHANG Lei1
（1.Department of Food Science，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003,Henan,China;2.Department of Foreign Language，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan,China）

2010-04-17

徐贵华（1977—），男（汉），讲师，博士，研究方向：天然产物化学。