韩宁宁，肖冬光，张翠英，胡亚丽，林康

（工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

木糖发酵生产2,3-丁二醇条件的优化

韩宁宁，肖冬光*，张翠英，胡亚丽，林康

（工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

利用一株肺炎克雷伯氏菌发酵木糖生产2,3-丁二醇，运用单因素试验和四因素三水平L9（34）正交试验设计的方法，探讨发酵pH、温度、装液量和转速对2,3-丁二醇产量的影响。结果表明：在木糖浓度80 g/L、接种量6%（体积分数）、初始pH值6.0、转速120 r/min、装液量80 mL/250 mL、35℃的条件下发酵84 h，木糖利用率为90%，2,3-丁二醇的质量浓度为33.0 g/L，得率为0.46 g/g，达到理论值的92%。

肺炎克雷伯氏菌；2,3-丁二醇；木糖；发酵

Abstract:The production of 2,3-butanediol was carried out from fermentation of xylose by Klebsiella pneumoniae.The effects of pH，temperature,amount of medium and rotation on 2,3-butanediol were studied by the single-factor tests and L9（34）orthogonal design experiment.The parameters of optimum fermentation were suggested as follows：xylose mass concentration 80 g/L,inoculum 6%（volume fraction），initial pH value 6.0，rotation120 r/min，amount of medium 80 mL/250 mL and 35℃，concentration of 2,3-butanediol reached 33.0 g/L and yield of 2,3-butanediol from xylose was 0.46 g/g.

Key words：Klebsiella pneumoniae；2,3-butanediol；xylose；fermentation

2，3-丁二醇（2，3-Butanediol，2，3-BD）是一种重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、医药、食品及航空航天等领域[1-4]。工业上生产2，3-丁二醇的主要方法是化学法，其生产2，3－丁二醇主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水解得到，然而随着石油危机的日趋加剧，寻找新的可替代能源成为迫切需要解决的问题[5-6]。微生物可以利用粮食或木质纤维素为底物生产2，3－丁二醇，其中利用葡萄糖为底物生产2，3－丁二醇研究较多。但由于粮食危机的存在，利用丰富而且廉价的可再生资源木质纤维类物质为原料发酵生产2，3－丁二醇成为必然趋势。木糖是木质纤维原料水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖,由半纤维素水解生成,含量可达植物纤维水解糖类的35%以上[7]。目前文献报道中多研究利用由木质纤维素降解的葡萄糖，木质纤维素的利用率仅为30%左右[8]，以木糖为底物发酵生产2,3-丁二醇的研究将会提高木质纤维类原料的利用率，可使木质纤维素的利用率达50%以上，在开发新能源和环境保护等方面具有重要的经济效益和社会效益[9-10]。本文研究了各种发酵条件对肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae 10011发酵木糖生产2,3-丁二醇的影响。

1 材料和方法

1.1 菌种

肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae，CICC，10011）：中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基（g/L）

葡萄糖20；蛋白胨10；酵母粉5；氯化钠10；琼脂20。

1.2.2 种子培养基（g/L）

木糖20；蛋白胨10；酵母粉 5；氯化钠10；pH 7.0。

1.2.3 发酵培养基（g/L）

木糖 80；酵母粉 15.0；KH2PO410.0；K2HPO410.0；（NH4）2SO42.0；柠檬酸钠 4.0；MgSO4·7H2O 0.4；CaCl20.05；FeSO4·7H2O 0.005；ZnSO4·7H2O 0.005；EDTA 0.05；pH 6.0。

1.2.4 试剂

2,3-丁二醇（Sigma，色谱纯），异戊醇（天津市光复精细化工研究所，色谱纯），D-木糖（博大泰克，分析纯），试验过程中使用的其他化学试剂均为分析纯以上级别。

1.2.5 主要仪器

7890A型气相色谱仪：美国安捷伦科技公司；722型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 发酵培养条件

种子培养：取一环斜面种子接入装有一定量液体培养基的250 mL三角中，置于37℃恒温培养箱静止培养24 h。按6%的接种量转接一级种子到250 mL三角瓶中，置于37℃恒温培养箱静止培养18 h。

初始发酵培养条件：按5%的接种量转二级种子培养基到发酵培养基中，250 mL三角瓶装液量为100 mL，初始pH为6.0，置于37℃摇床上发酵，摇床转速为100 r/min。其中初始pH值、温度、装液量、接种量、转速、木糖浓度各单因素在优化过程中会进行相应的变化。

1.4 分析方法

1.4.1 木糖浓度的测定

采用地衣酚法[11]。发酵液于4000 r/min转速下离心15 min，取上清液适当稀释，使稀释液中木糖浓度控制在 0 μg/mL~33 μg/mL 范围内。

1.4.2 2,3-丁二醇浓度的测定

用乙酸乙酯与发酵液离心上清液以体积比1∶1进行萃取，待静置分层后取上层液进行气相分析。

气相色谱具体测定条件如下：色谱柱：Aglient HPINNOWax 1909IN-213；柱长：30 m；内径：0.320 mm；检测器：FID（250℃）；柱温：180℃；进样温度：230℃；载气压力：氮气（1.8 mL/min）；氢气（30 mL/min）；空气（300 mL/min）；内标物：异戊醇。

2 结果与讨论

2.1 pH值对2,3-丁二醇产量的影响

pH在调节细菌的代谢过程中起着重要的作用，尤其是在含有大量复合产物的发酵过程中，pH对发酵结果的影响尤为明显。本试验将发酵液初始pH值调至不同水平，考察了初始pH值对丁二醇产量的影响，试验结果见表1。

表1 初始pH值对2,3-丁二醇产量的影响Table 1 Effects of initial pH to 2,3-butanediol

从表1可以看出，当pH值为6.0时木糖的利用率及2,3-丁二醇的得率均达到最大值，当pH值低于或高于6.0时木糖利用率及2,3-丁二醇质量浓度均有明显下降，可见pH值对该发酵过程影响较为显著，其适宜的pH值为6.0。

2.2 温度对2,3-丁二醇产量的影响

通常细菌发酵的最适温度范围是30℃～37℃[12]，本试验检测了这个范围内的温度变化对发酵木糖产2,3-丁二醇的影响，试验结果见表2。

表2 温度对2,3-丁二醇产量的影响Table 2 Effects of temperature to 2,3-butanediol

表2结果显示，在30℃~37℃之间，木糖利用率和2,3-丁二醇的得率均随着温度呈先升高后降低的趋势，在35℃时木糖利用率及2,3-丁二醇的得率达到最高。

2.3 装液量对2,3-丁二醇产量的影响

通气量对于2,3-丁二醇发酵具有重要的影响，摇床转速固定在100 r/min，调节不同装液量进行发酵，考察装液量对丁二醇产量的影响，试验结果见表3。

由表3可知：装液量太大，溶氧效果差，2,3-丁二醇的产量低；装液量太小，溶氧过大，也降低了2,3-丁二醇的产量，结果表明l00 mL/250 mL装液量最好。

2.4 接种量对2,3-丁二醇产量的影响

接种量通常也是影响发酵的一个重要因素，本试验考察了不同接种量对发酵木糖产2,3-丁二醇的影响，试验结果见表4。

表3 装液量对2,3-丁二醇产量的影响Table 3 Effects of amount of medium to 2,3-butanediol

表4 接种量对2,3-丁二醇产量的影响Table 4 Effects of inoculum to 2,3-butanediol

由表4可知，接种量为6%时发酵木糖产生的2,3-丁二醇量最高。接种量小时，木糖利用率低，产生的2,3-丁二醇的量也低；接种量过大时，发酵液中2,3-丁二醇的量降低，可能的原因是接种量过大时，底物中糖含量不足以满足菌种生长需要，营养物过早耗竭，导致菌体过早自溶影响2,3-丁二醇产量。

2.5 转速对2,3-丁二醇产量的影响

2,3-丁二醇是典型的微好氧代谢产物，2,3-丁二醇的形成与溶氧有密切的关系，随着溶解氧的升高，2,3-丁二醇的形成量增高，但是溶氧量过高，反而使产量下降[13]。本试验考察了不同转速对2,3-丁二醇产量的影响，试验结果见表5。

表5 转速对2,3-丁二醇产量的影响Table 5 Effects of rotation to 2,3-butanediol

由表5可知：不同的摇床转速对2,3-丁二醇的产量有很大的影响。当摇床转速控制在125 r/min，2,3-丁二醇的产量最大。

2.6 初始木糖浓度对2,3-丁二醇产量的影响

木糖质量浓度也会对发酵有较大影响，试验结果见表6。

表6 初始木糖浓度对2,3-丁二醇产量的影响Table 6 Effects of xylose concentration to 2,3-butanediol

从表6中本试验结果可以看出，初始木糖浓度较低时，木糖利用率较高；而当初始木糖质量浓度继续升高时，木糖利用率明显下降，可能是菌体生长受到一定的抑制作用[14]。随着初始木糖质量浓度的升高，2,3-丁二醇的得率先增加后减少，在80 g/L时达到最大，为0.45 g/g，确定为最佳木糖发酵浓度。

2.7 L9（34）正交试验

由单因素优化试验可知，pH值、温度、装液量、转速对木糖发酵产2,3-丁二醇影响较大，因而选取这4个因素进行L9（34）正交试验。每一试验条件重复3次，共27组试验，2,3-丁二醇产量取3组试验产量的平均值，试验设计及结果分析见表7、表8和表9。

表7 正交试验因素水平表Table 7 The levels of factors table of orthogonal experiment

表8 正交试验的极差分析Table 8 The analysis of range of orthogonal experiment

从表7的直观分析和表8的F值可知，4因素对木糖发酵产2,3-丁二醇影响的显著性次序为：转速＞pH值＞温度＞装液量。4因素的最佳配比为A2B2C1D2，即pH为6.0、温度为35℃、装液量为80 mL/250 mL、转速为120 r/min。根据方差分析，pH值、温度和转速都是影响较为显著的因素。

表9 正交试验方差分析Table 9 The analysis of variance of orthogonal experiment

注：**代表极显著。

表10 验证试验结果Table 10 Results of identification experiment

表10为在最佳配比A2B2C1D2的条件下对木糖产2,3-丁二醇的发酵条件进行重复性验证试验，2,3-丁二醇平均浓度可达33.0 g/L，试验结果高于预试验和正交设计优化9个试验号，从而证明了优选发酵条件的合理性。验证试验结果都在95%置信区间内，说明正交试验有较高的准确性。

3 结论

1）利用木糖为底物生产2,3-丁二醇，通过对发酵条件的优化，使2,3-丁二醇产量达到33.0 g/L，为木质纤维素的利用和开发奠定了良好的基础。

2）木糖单因素试验结果显示，木糖发酵产2,3-丁二醇存在底物抑制现象，可以通过流加底物补料发酵解决这个问题，从而2,3-丁二醇产量有望进一步得到提高，同时提高了木质纤维素的利用率。

[1]Syu MJ.Biological production of 2,3-butanediol[J].Appl Microbiol Biotechnol,2001,55：10-18

[2]Garg SK,Jain A.Fermentative production of 2,3-butanediol：a review[J].Bioresour Technol,1995,51：103-109

[3]Ji XJ,Huang H,Du J，et al.Enhanced 2,3-butanediol production by Klebsiella oxytoca using a twostage agitation speed control strategy[J].Bioresour Technol 2009，100：3410-3414

[4]Ji XJ,Huang H,Li S，et al.Enhanced 2,3-butanediol production by altering the mixed acid fermentation pathway in Klebsiella oxytoca[J].Biotechnol Lett 2008，30：731-734

[5]Frazer FR,Mc Caskey TA.Effect of components of acid-hydrolysed hardwood on conversion of D-xylose to 2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae[J].Enzyme Miocrobil Technol,1991,13：110-115

[6]Zald Ivar J,Niel Sen J,Olsson L.Fuel ethanol production from lignocellulose：a challenge formetabolic engineering and process integration[J].Applied Microbiology Biotechnology,2001,56(1/2)：17-34

[7]纪晓俊,朱建国,高振，等.微生物发酵法生产2,3-丁二醇的研究进展[J].现代化工,2006,26(8)：23-27

[8]Chandrakant P,Bisaria VB.Simultaneous bioconversion of glucose and xylose to ethanol by Saccharomyces cerevisiae in the presence of xylose isomerase[J].Applied Microbiology Biotechnology,2000,53(3)：301-309

[9]Perez J,Munoz-Dorado J,de la Rubia T，et al.Biodegration and biological treatments of cellulose and lignin：an overiew.Int Microbiol,2002,5：53-63

[10]Ma C,Wang A,Qin J，et al.Enhanced 2,3-butanediol production by Klebsiella pneumoniae SDM[J].Appl Microbiol Biotechnol，2009，82：49-57

[11]伍时华,张健,方杰，等.地衣酚法定量测定发酵液中D-核糖的研究[J].广西工学院学报,2000(4)：55-59

[12]Perlman D.Production of 2,3-butylene glycol from wood hydrolyzates[J].Ind Eng Chem,1944,36：803-804

[13]Perego P,Converti A.Effects of temperature,inoculum size and starch hydrolyzate concentration on butanediol production by Bacillus licheniformis[J].Bioresource Technology,2003,89(22)：125-131

[14]Goleau D,Laube VM,Martin SM.Effect of various atmospheric conditions on the 2,3-butanediol fermentation from glucose by Bacillus polymyxa[J].Biotechnology Letters,1985,7(1)：53-58

Optimization of Fermentation Conditions for 2,3-Butanediol from Xylose

HAN Ning-ning,XIAO Dong-guang*，ZHANG Cui-ying，HU Ya-li,LIN Kang
（Key Laboratory of Industrial Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

2010-04-28

天津科技大学自然科学基金，项目编号：20090401

韩宁宁(1983—)，女（汉），硕士研究生，研究方向：现代酿造技术。

*通信作者