李燕杰，朱小花，夏雨，袁根良，杨公明

（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

不同培养条件对单增李斯特菌生物被膜形成的影响研究

李燕杰，朱小花，夏雨，袁根良，杨公明*

（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

研究生物被膜态微生物的特性，以常见的食源性病原菌单核细胞增生性李斯特菌为研究对象，分别采用微孔平板和结晶紫染色法培养、观察、检测不同培养条件下被膜的形成与生长。试验结果表明：在35℃，中性略偏碱性条件下，TSB培养6 h～8 h，单增李斯特菌可形成稳定的生物被膜，添加适量的氯化钠和葡萄糖可提高单增李斯特菌形成被膜的能力，揭示富营养环境有利于单增李斯特菌形成被膜。

单核细胞增生性李斯特菌；生物被膜；形成；培养条件

Abstract:Listeria monocytogenes,as one of the most common foodborne pathogenic bacterium,which was used in this study to research the characters of microorganisms in biofilm status.Microtiter-plate method and crystal violet staining were used to stimulate biofilm formation and determination the biomass.The results showed that L.monocytogenes formed stable biofilms at 35℃under neutral and alkalescence condition,culturing for 6 to 8 hours in TSB.The ability of Listeria monocytogenes formed biofilms would be improved by adding proper sodium chloride and glucose in culture medium.The results suggest that eutrophic condition is beneficial to the forming of Listeria monocytogenes biofilm.

Key words：Listeria monocytogenes;biofilm;formation;culture condition

自20世纪70年代末加拿大微生物学家J.William Costerton首次正式提出生物被膜（biofilm,简称BF）的相关理论以来[1-2]，越来越多的研究人员逐渐发现自然界中各种微生物并非以单个的浮游状态存在，更多的是以群体的被膜形式生存[3-4]。所谓生物被膜是由附着于惰性或活性实体表面的微生物细胞和包裹微生物的水合性基质所组成的结构性微生物群落，是微生物黏附表面生活时所采取的一种特殊生存状态[5-6]。生物被膜与常见的浮游状态微生物有着本质的不同，其抗性更强、危害更加严重，且更难清除[7-8]。

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称LM、单增李斯特菌）是一种对人畜危害极为严重的人畜共患病病原菌，也是目前国际公认的重要食源性病原菌之一[9-10]。食品加工原辅料富含营养物质，可为单增李斯特菌生物被膜的形成及生长创造有利条件。例如Charlton、Gulten等报道从156家乳品加工厂中取得的597份样品经检测发现有超过12.6%的样品检出含有李斯特菌，其中50.7%为单增李斯特菌[11-12]。一旦食品加工环境不慎感染单增李斯特菌并形成生物被膜后，就会显著增强其对消毒剂及光、热、紫外线等的耐受性，这就使得常规的杀菌方法不能有效灭菌。同时，单增李斯特菌形成的生物被膜还有可能是其它致病菌及腐败微生物的藏身之所，从而增加了导致食品加工环境以及食品本身污染或发生二次污染的风险，甚至会引起食物中毒事件[13-15]。因此研究和防范单增李斯特菌生物被膜的形成具有及其重要的意义。

由于生物被膜的形成受菌种、菌量、时间、营养条件、生长环境及载体表面等诸多因素的影响[16-19]，了解这些因素对生物被膜形成的影响可为研究生物被膜的特性及控制被膜的形成提供参考。本文采用96孔细胞培养板模拟并检测单增李斯特菌生物被膜的形成与生长过程，通过光密度值反映被膜的菌量，从而可以揭示不同培养条件对单增李斯特菌生物被膜生长的影响规律。

1 材料与方法

1.1 菌种、主要仪器与试剂

1.1.1 菌种

单核细胞增生李斯特菌（GIM1.229）：购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。

1.1.2 主要仪器

超净工作台：苏净集团安泰公司；显微镜LRH-250-Ⅱ：Nikon Coolscope，JAPAN；生化培养箱：广东医疗器械厂；荧光检测仪FS1000：美国PerkinElmer公司；FEI-XL30环境扫描电子显微镜：荷兰菲利普电子光学有限公司；SCD 500离子溅射仪：瑞士Bal-Tec公司；CPD 030临界点干燥仪：瑞士Bal-Tec公司。

1.1.3 主要试剂和材料

TSB培养基，甲醇，结晶紫，氯化钠，葡萄糖，96孔细胞培养板等。

1.2 方法

1.2.1 单增李斯特菌生物被膜的制备

将单增李斯特菌菌液接种在无菌TSB培养液中37℃培养过夜，活菌数达到约108cfu/mL备用。接入一定量菌液于96孔细胞培养板中，培养一定时间后备用。

1.2.2 生物被膜光密度值的测定

培养结束后，弃去96孔板中的培养基，250 μL生理盐水（已灭菌）冲洗3次，30℃自然风干后每个孔中加入25 μL结晶紫（1%结晶紫水溶液），静置染色20 min，弃去染色液，自来水冲洗直至无色、晾干；此时，每个孔的两边都可以看到紫色的环形成即可判断形成了BF，在染色的板中加入250 μL、95%的乙醇脱色，用空白孔以250 μL培养基作为空白调零，测A595nm处吸光值[20-21]。

1.2.3 李斯特菌生物被膜的染色观察

将培养一定时间的单增李斯特菌被膜，弃去培养基，用无菌水漂洗3次后晾干，1%结晶紫染色20 min，无菌水冲洗、晾干后显微镜观察。

1.2.4 扫描电镜观察李斯特菌生物被膜生长的影响

取出培养一定时间的生物被膜，将载体经无菌操作切割为可供扫描电镜观测大小后，灭菌PBS溶液多次充分漂洗，去掉浮游菌，经2.5%戊二醛PBS溶液固定过夜后，用PBS溶液冲洗数遍，再经1%的锇酸固定1 h，50%、70%、80%、90%系列浓度乙醇脱水各10 min，100%乙醇脱水2次，每次15 min，再经醋酸异戊醋置换2次，每次15 min，临界点干燥仪干燥，再喷金，扫描电镜观察。

1.2.5 培养时间对李斯特菌生物被膜生长的影响

在细胞培养板中分别加入TSB溶液230 μL，再接入20 μL李斯特菌液，将培养板分别置于35℃培养一定时间后进行试验测定（方法同1.2.2）。

1.2.6 不同温度下培养基浓度变化对李斯特菌生物被膜生长的影响

在细胞培养板中分别加入不同浓度的TSB溶液（5%、20%、100%）230 μL，并接入李斯特菌菌液20 μL（108cfu/mL），将培养板分别置于 5、15、25、35、45℃培养24 h，进行光密度测量，平行试验3次，取其平均值；以无菌水作为对照进行光密度测量。

1.2.7 不同pH值对李斯特菌生物被膜生长的影响

在细胞培养板中分别加入pH分别为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9 的 TSB 溶液 230 μL，再接入 20 μL李斯特菌菌液，进行培养和试验（方法同1.2.2），平行试验3次。

1.2.8 NaCl浓度对李斯特菌生物被膜生长的影响

在细胞培养板中分别加入含不同浓度的氯化钠（0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）的 TSB培养基230 μL进行培养和试验（方法同1.2.2），平行试验3次。

1.2.9 葡萄糖浓度对李斯特菌生物被膜生长的影响

在细胞培养板中分别加入含不同浓度的葡萄糖（0%、2%、4%、6%、8%、10%）的TSB培养基230 μL进行培养和试验（方法同1.2.2），平行试验3次。

2 结果与分析

2.1 单增李斯特菌生物被膜形成过程

图1为采用结晶紫染色、普通显微镜观察到的李斯特菌生物被膜，其中a为培养4 h后的李斯特菌生物被膜，从图1中可见仅少量菌体附着于载体表面，菌体间呈散落的网状结构；b为同一菌株培养6 h后观察到的显微镜照片，其中附着菌体数目逐渐增多，且菌体间呈连续的紫色网状结构；c为培养8 h后观察到的照片，视野中附着菌体数目明显增加，且菌体相连呈现出更为清晰的紫色网状结构；d为培养12 h后观察到的照片，视野中菌体数目大量增加，并黏结聚集呈紫色网状结构，且局部菌体大量密集呈团状。

图2为同种方法培养相应时间后采用电子扫描显微镜观察到的李斯特菌生物被膜，如图2所示，培养4 h后，少量菌体可附着于载体表面；随着培养时间的延长，载体表面附着的菌体数目逐渐增多，并分泌大量胞外物质将菌体包裹于其中。

不同培养时间对单增李斯特菌生物被膜OD值的影响如图3所示。

由图1、图2照片和图3数据可知，0 h~6 h为被膜菌的附着期，是被膜的初始形成期；6 h~8 h后黏附细菌逐渐增多，可形成初具规模的生物被膜，8 h后单增李斯特菌生物被膜基本处于稳定状态，可认为8 h后为李斯特菌生物被膜的成熟稳定期。

2.2 不同温度和培养基浓度对李斯特菌生物被膜生长的影响

在不同培养温度下TSB浓度变化对单增李斯特菌生物被膜OD值的影响见图4。

如图 4所示，在 5、15、25、35、45 ℃等不同温度下分别培养24 h后，李斯特菌生物被膜的OD值随温度和TSB浓度的升高而增加，但超过35℃后随之下降。说明35℃左右是有利于李斯特菌生物被膜的生长温度，富营养环境有利于李斯特菌生物被膜的生长。

2.3 不同pH值对李斯特菌生物被膜生长的影响

不同pH值对李斯特菌生物被膜生长的影响见图5。由图5可见中性略偏碱性条件有利于单增李斯特菌生物被膜的形成，酸性和碱性条件下单增李斯特菌生物被膜的形成均会受到抑制。

2.4 NaCl浓度对李斯特菌生物被膜生长的影响

不同NaCl浓度对李斯特菌生物被膜生长的影响见图6。

如图6所示，李斯特菌生物被膜的OD值随NaCl浓度升高先增加后下降，说明低浓度的NaCl（低于0.5%）可促进单增李斯特菌生物被膜的形成，NaCl浓度升高则会抑制单增李斯特菌生物被膜的形成。

2.5 葡萄糖浓度对李斯特菌生物被膜生长的影响

葡萄糖浓度变化对李斯特菌生物被膜生长的影响见图7。

如图7所示，李斯特菌生物被膜的OD值随葡萄糖浓度增加而升高，但当其浓度大于6%以后对单增李斯特菌生物被膜形成的影响效果不甚明显。说明添加适量葡萄糖有利于单增李斯特菌生物被膜的形成。

3 结论

研究发现：①李斯特菌生物被膜在试验条件下，6 h~8 h即形成较为稳定的BF；②培养时间、营养条件、培养温度、pH值、NaCl浓度、葡萄糖浓度等多种因素变化均会影响李斯特菌生物被膜的形成，富营养环境、中性及微碱性条件、接近最适生长温度的培养温度均可促进单增李斯特菌生物被膜的形成，此外，低浓度的NaCl和葡萄糖也有利于单增李斯特菌形成生物被膜。③由于单增李斯特菌在4℃左右还可以继续缓慢生长，因此其在低温下也可以形成生物被膜，单增李斯特菌的这种耐冷性质使得它对于冷藏温度下存放的即食食品存在极大的危险，因为即使染菌数量很小也可以在储存期间大量繁殖。因此为保证食品企业加工产品的安全，首先应严格控制食品加工过程中的微生物，特别是病原菌；其次，应缩短加工设备、器具、生产车间的清洗时间，避免微生物在其上附着并形成生物被膜；并制定在BF形成前清洗的工艺；最后，低温加工车间及冷库中也不能放松微生物控制，需防止及有效抑制嗜冷菌在低温条件下的生长繁殖。

[1]Hans P Blaschek,Hua H Wang,Meredith E Agle.Biofilms in the Food Environment[M].Oxford：Blackwell Publishing Ltd,2007：34－50

[2]CosteronJW.Introductiontobiofilm[J].Internationaljournalantimicrob agents，1999(11)：217－221

[3]易华西，王专，徐德昌.细菌生物被膜与食品生物危害[J].生物信息学，2005，3(4)：189-191

[4]陈维贤，张莉萍.细菌生物被膜的研究进展[J].微生物学杂志，2004，24(1)：46-48

[5]李燕杰，杨公明，朱小花，等.从生物被膜看食品机械安全性设计准则的必要性[J].农业工程学报，2008，24(11)：302-307

[6]张吉红，陆承平.嗜水气单胞菌生物被膜的特性与相关基因的研究[J].南京农业大学学报，2005，28(3)：75-78

[7]杨葆华，韩北忠，陈晶瑜，等.超声波平板法检测金黄色葡萄球菌生物被膜的研究[J].食品研究与开发，2007，28(10)：136-139

[8]段韵涵，韩北忠，杨葆华，等.培养条件对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响[J].中国酿造，2008(2)：17-20

[9]马瑜丹.单核细胞增生李斯特菌菌膜形成突变株的筛选[D].上海交通大学,2008：78-94

[10]沈晓盛,郑国兴,李庆,等.食品中单核细胞增生李斯特菌的危害及其检测[J].食品与发酵工业,2004,30(8)：87-91

[11]Gulten Tiryaki Gunduz，Gunnur Tuncel.Biofilm formation in an ice cream plant[J].Antonie van Leeuwenhoek,2006(89)：329-336

[12]Charlton B R,Kinde H,Jensen L H.Environmental survey for Listeria species in California milk processing plants[J].J.Food Protect，2005,53：198-201

[13]王丽英.生物膜的形成与控制[J].食品科学,1999(1)：10-12

[14]刘爱萍.细菌生物膜与食品安全[J].肉类工业，2007(8)：34－35

[15]Anonynity assessing the in-place cleanability of food-processing equipment[J].TrendsinFoodScience&Technology，2006：139－153

[16]Ganesh Kumar G,Anand S K.Significance of microbial biofilms in food industry：a review[J].International journal of food microbiology，1998，42：9－27

[17]Erna Storgards.Process hygiene control in beer production and dispensing[D].Helsinki：University of Helsinki，2000

[18]BronwynE Ramey,Maria Koutsoudis,Susanne Bvon Bodman.Biofilm formation in plant microbe associations[J].Current opinion in microbiology，2004(7)：602－609

[19]Mattila-Sandholm T,Wirtanen G.Biofilm formation in the industry：a review[J].Food Reviews Internationl，1992，8(4)：573－603

[20]钱群英.嗜水气单胞菌生物被膜的形成和估算方法[D].南京农业大学，2006

[21]O’Toole G A，Kolter R.Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens wc365 proceeds via multiple,convergent signaling pathways：a genetic analysis[J].Mol.Microbial，1998，28(2)：449－461

The Influence of Various Culture Conditions on Listeria Monocytogenes Biofilm Formation

LI Yan-jie,ZHU Xiao-hua,XIA Yu,YUAN Gen-liang,YANG Gong-ming*
（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

2010-06-11

李燕杰（1983—），女（汉），博士研究生，研究方向：食品加工与安全。

*通信作者：杨公明（1950—），男（汉），教授，博士生导师，研究方向：食品/农产品加工。