贾红卫，赵玉

（青海出入境检验检疫局，青海西宁810000）

自动固相萃取-高效液相色谱-紫外检测法测定肉和肉制品中的三聚氰胺残留

贾红卫，赵玉*

（青海出入境检验检疫局，青海西宁810000）

用Venusil ASB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为庚烷基磺酸钠∶乙腈（pH3.2）=90∶10（体积比），流速为1.0 mL/min，检测波长240 nm的色谱条件下，经提取处理并经混合型阳离子交换柱固相萃取净化，对肉及肉制品中的三聚氰胺残留进行测定，结果表明在0.5 μg～100.0 μg之间有较好的线性关系，r=0.9996。回收率在87%～94%，RSD 为 3.8%～4.2%（n=6）。

自动固相萃取；高效液相色谱-紫外检测；三聚氰胺残留；肉和肉制品

Abstract:By high performance liquid chromatography-variable wavelength detector（HPLC-VWD）,the determination of melamine residue in meat and meat products was reported in this paper.Acetonitrile：water solution （50∶50）was used to precipitate proteins and to dissociate the target anlyte from the samples matrix.After an appropriate ultrasonic and centrifugal pretreatment,the supernatant was cleaned up with strong cation exchange column and separated on a C18column（4.6×250 mm，5 μm）with 0.01 mol/L sodium 1-heptanesulfate：acetonitrile （90∶10,Volume ratio）as mobile phase,at a flow rate of 1.0 mL/min and detected at 240 nm.The limit detection was 1.0 mg/kg,the average recovery was 87%-94.2%,and the response value was linear between 1.0 μg-100.0 μg,r was 0.9996.With an average RSD of 3.8%-4.2%（n=6）is obtained.

Key words：Solid phase extraction；HPLC-VWD；melamine residue；meat and meat products

三聚氰胺（melamine）又称三氨三嗪，简称三胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，白色无味结晶粉末。这种化学品常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂，在部分亚洲国家，它也被用于制造化肥，但严禁加入食品和饲料中。自2008年9月奶粉事件后，最近，又在鸡蛋中检出了三聚氰胺，从而引发由于食用饲料使动物及其内脏也含有三聚氰胺的担忧。目前关于三聚氰胺残留测定方法有GC-MS法、GC，LC-UV法、LC-MS等[1-2]，但在实际工作中，检测对象均为乳制品、饲料等[3-4]。关于动物肉制品和内脏中三聚氰胺的检测方法鲜见报道。本文建立了自动固相萃取，HPLC-UV检测动物肉及肉制品中三聚氰胺的方法，用乙腈和水提取，含离子对缓冲液在高亲水性C18柱进行分析。大量样品分析结果表明，该方法快速、简单、经济，可作为进出口动物肉和肉制品中三聚氰胺的一种快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

HP1100高效液相色谱仪-紫外检测器：美国Agilent公司；自动固相萃取仪：法国Gilson公司；纯水器：美国密理伯公司；组织捣碎机；混合型阳离子交换柱（PCX，60 mg/3 mL）：美国Agela公司；三聚氰胺标准品：购买自Acros organics公司（纯度≥99%）。甲醇、乙腈色谱纯：Fisher公司；三氯乙酸、庚烷磺酸钠、柠檬酸、氨水（含量约28%）：均为分析纯；超纯水。样品来源：青海肉食品出口企业送检样品。

1.2 色谱条件

色谱柱 Venusil ASB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，Agela公司）；流动相：0.01 mol/L 庚烷磺酸钠(柠檬酸溶液调节 pH 至 4.5)+乙腈(体积比为 90∶10)，等度洗脱，流速为 1.0 mL／min；柱温：30 ℃；检测波长为 240 nm；进样体积为 20 μL。

1.3 样品制备

1.3.1 样品提取

取肉样，去可见脂肪组织，称取（5.00±0.05）g样品于 50 mL 离心管中，加 25 mL 乙腈-水（50∶50），组织捣碎机高速匀浆1 min，超声提取20 min，3500 r/min离心10 min，使组织充分沉淀。精密取5 mL上清液至50 mL离心管中，加入0.01 mol/l HCl 5 mL并摇匀,加入正己烷10 mL，振荡2 min，3500 r/min离心10 min，使其分层。将上层水溶液移至另一个带盖的离心管中，用水充分洗涤正己烷层以充分去除脂肪，合并水溶液并离心3500 r/min，10 min，上清液为待净化液。

1.3.2 样品净化（固相萃取参数）

活化：甲醇、水各3 mL，上样：待净化液8 mL，淋洗：甲醇、水各 3 mL 空气抽干，洗脱：2 mL×3次，5%氨水甲醇溶液过柱，浓缩，氮气吹干，流动相定容至1 mL，涡旋混匀，0.45 μm有机系滤膜过滤，HPLC-UV测定。

1.4 三聚氰胺标准溶液的配制

将三聚氰胺标准品用20%甲醇配制成1.0 g/L的储备液，避光冷藏保存。

临用时用流动相溶液稀释到相应的浓度，制成标准工作溶液。

2 试验结果与分析

2.1 提取剂的选择和提取条件的优化

三聚氰胺属于强极性碱性化合物，因此提取溶剂一般都选用极性较强的有机溶剂、缓冲溶液或有机溶剂和水的混合溶液。本试验中分别考察了甲醇、乙腈、乙腈水溶液、1%三氯乙酸溶液、1%乙酸铅溶液沉淀蛋白并提取三聚氰胺的效果。在空白肉样中添加20 mg/kg水平的三聚氰胺标准品，用HPLC-UV测定其回收率，以比较不同提取剂的提取效果，结果见表1。

从表1的结果可以看出纯有机溶剂的提取回收率低，其余溶剂的提取效率在75%~95%之间，乙腈水溶液和1%三氯乙酸水溶液提取率高而且都能够有效的沉淀蛋白质，但考虑到三氯乙酸、乙酸铅的使用会影响色谱柱的使用寿命，甚至会造成色谱系统的堵塞，对色谱分析中的峰形也产生影响，而乙腈水溶液沉淀蛋白的效果良好，三聚氰胺的回收率在90%以上，提取液与流动相的组成基本相同，有利于保护色谱系统，故本文最终选择选用乙腈水溶液作为提取溶剂。

脂肪组织的极性很小，三聚氰胺的极性很大，所以脂肪里面基本不会含有三聚氰胺，用正己烷提除脂肪残留，以避免对色谱分析造成影响。

由于三聚氰胺溶解性较弱，提取时间对回收率也有较大影响，摸索并最终确定超声提取20 min效果最佳。

三聚氰胺呈弱碱性，净化过程一般选择阳离子交换柱，选用的混合型阳离子交换柱（PCX）由于具有阳离子和反相2种吸附机理，使样品净化更彻底，提高了检测灵敏度，批次重复性好，回收率也较高。在样品液中加0.01 mol/L HCl盐酸可以增加C18柱对三聚氰胺的保留和改善峰形。

表1 不同提取溶剂对肉制品中三聚氰胺提取效果的比较（n=6）Table 1 Extraction eficiency of melamine in samples by diferent solvents(n=6)%

2.2 色谱条件的优化

三聚氰胺在传统的C18柱上保留差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留和分离，参考文献[7]方法，在流动相中加入庚烷磺酸钠使三聚氰胺产生很好的保留。分析结果发现，本方法中三聚氰胺的保留时间在7.2 min左右，没有干扰峰，见色谱图1。

2.3 线形分析、检出限

用流动相配制的相应浓度三聚氰胺系列标准溶液为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。结果表明，本方法在浓度为0.5 mg/kg时相关系数为0.9996，回归方程线为 Area=76.6Amt-2.8，说明在设定的浓度范围内线性关系良好。

在空白肉样中添加三聚氰胺标准溶液，HPLC—UV方法的检测低限为0.5 mg/kg[按信噪比（s/N）大于3计算]。

2.4 回收率和精密度试验

取经检验不含三聚氰胺的样品，分别按样品中0.5、10.0、50.0 mg/kg含量水平添加一定量的三聚氰胺标准溶液，每一添加浓度重复6份样品，按上述方法测定，计算其回收率和精密度，结果见表2。

表2 肉空白样品中添加不同浓度的三聚氰胺标准品后的回收率和精密度试验结果（n=6）Table 2 Recovery and precision of melamine spiked in blank meat（n=6）

2.5 样品的检测

对本地出口的肉类进行检测，均未检出三聚氰胺，非常适合实际应用。

3 结论

本研究建立了对肉和肉制品中的三聚氰胺残留量的检测方法。并通过试验，确定了自动固相萃取的最佳淋洗液、洗脱液比例以及洗脱液用量，优化了提取和测定的条件，三聚氰胺的检出限为0.5 μg/mL，0.5 μg～100.0 μg 之间回收率为 87%～94% ，RSD 为3.8%～4.2%，线性相关系数r=0.9996。符合残留分析方法的相关规定。试验结果表明方法本文建立的具有特异性强、前处理简单、重复性好、检测快速等特点，对本地出口的肉类进行检测，均未检出三聚氰胺，非常适合实际应用。

[1]吴惠勤，黄芳，林晓珊，等.气相色谱-质谱法测定奶粉及奶制品中的三聚氰胺[J].分析测试学报，2008，27(10)：1044-1048

[2]栾伟.液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)分析宠物食品中三聚氰胺[J].分析测试学报，2007（z1）：285-286

[3]蔡勤仁，欧阳颖瑜，钱振杰，等.超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺[J].色谱，2008,26(3)：339-342

[4]汪辉，彭新凯，李文丽，等.高效液相色谱测定生鲜乳及乳制品中三聚氰胺的方法研究[J].食品科学,2008，29(10)：531-535

[5]宋书锋，鲁杰，等.GB/T22388-2008：原料乳和乳制品中三聚氰胺的检测方法[S].北京：国家标准出版社2008：2-4

Determination of Melamine Residue in Meat and Meat Products by Phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography Solid

JIA Hong-wei，ZHAO Yu*
（Qinghai Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau,Xining 810000,Qinghai,China）

2010-05-08

贾红卫（1967—），男（汉），高级工程师，硕士，从事食品安全研究。

*通信作者