李睿，戴诗皎，杨敬镜，瞿敏，刘志国

（武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430023）

食品中产志贺毒素大肠杆菌的多重PCR检测

李睿，戴诗皎，杨敬镜，瞿敏，刘志国

（武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430023）

针对产志贺毒素大肠杆菌的stx2、wzy、hlyA的保守序列，设计特异性的引物，建立一种新的多重PCR检验方法。结果显示，该方法特异性强，扩增结果与各参考菌株基因型一致，并能良好的区分出O157菌株和非O157型产志贺毒素大肠杆菌。该方法能用于食品样品的检测和流行病学分离株的快速鉴定。

产志贺毒素大肠杆菌；多重PCR；hlyA；stx2；wzy

Abstract:Specific primers were designed according to the conserved loci of stx2,wzy and hlyA genes of Shiga toxin-producing Escherichia coli（STEC）.A Multiplex PCR method was then developed.The result demonstrated that this method was highly specific.It detected the presence of the three target genes in a manner consistent with the known genotype of each reference strain.O157 and non-O157 STEC strains could also be well distinguished.The multiplex PCR developed in this study could be used for mass screening of food samples,and identification of clinical STEC isolates.

Key words：Shiga toxin-producing Escherichia coli;multiplex PCR;hlyA;stx2;wzy

产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC；或称 Vero toxin-producing Escherichia coli,VTEC）是食品主要病原菌之一[1]。STEC 包括 O157：H7、O157：H- 、O6、O26、O111、O91 等血清型[2]。世界上许多国家相继发生了STEC的感染流行，对食品安全造成严重危害[3]。STEC主要毒力因子是stx1、stx2基因，分别编码志贺毒素1和志贺毒素2。两种毒素毒力不同，志贺毒素2比志贺毒素1毒力更强,更易引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症等食物中毒并发症[4]。大质粒上编码溶血素的hlyA基因亦是STEC重要毒力因子[5]。目前STEC的检测是一个难点。以O157特异的标志基因-O抗原聚合酶基因wzy和stx2、hlyA基因开发多重PCR检测技术，为检测食品中的STEC菌株提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

大肠杆菌 O157：H7 EC1、EC2、EC3：均为日本九州大学生命科学与技术学院食品卫生实验室赠送；大肠杆菌O157：H7 EC4号菌株、单核增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌：武汉市疾病预防控制中心提供；大肠杆菌O157：H7 EC5号菌株、普通大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌由武汉工业学院食品安全实验室保存。

1.1.2 试剂

CT-SMAC培养基：青岛海博生物技术有限公司；新生霉素：上海创赛科学仪器有限公司；GoldView核酸染料：上海赛百盛基因技术有限公司；AxyPrep细菌基因组试剂盒、Taqmix预混合PCR试剂盒武汉华顺生物技术有限公司；DNA marker、引物合成：武汉鼎国生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制备

将O157菌株接种到LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后用AxyPrep细菌基因组试剂盒提取DNA。

1.2.2 多重PCR检测体系

PCR 体系为：8 μL dd H2O,12.5 μL 2×Taqmix 混合液，10 μM wzy 上下游引物各 1 μL,10 μM stx2 上下游引物各 0.5 μL,10 μM hly 上下游引物各 0.25 μL,1 μL DNA。PCR扩增程序：94℃变性1 min,55℃45 s，72℃60 s，共35个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3 多重PCR特异性实验

用本实验室保存的各种菌株提取DNA，做多重PCR检测，确定引物的特异性。

1.2.4 多重PCR灵敏度实验

用大肠杆菌EC1号菌株DNA为模板，梯度系列稀释后，做多重PCR检测，确定灵敏度。

1.2.5 人工染菌样品实验

将EC1号菌株LB液体培养基过夜培养16 h～20 h，然后10倍梯度稀释。取100 μL梯度稀释菌液营养琼脂平板培养，进行菌落计数。同时取无大肠杆菌O157感染的新鲜牛肉25 g,将牛肉均质，加入10－1梯度稀释菌液，振荡混合0.5 h。取1 mL混合液，离心后用AxyPrep细菌基因组DNA试剂合提取DNA。然后梯度稀释，进行多重PCR，确认检出限。

2 结果与分析

2.1 多重PCR引物设计

在 NCBI GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下载wzy和stx2基因序列，在保守区内设计引物。hlyA基因引物参照文献[6]。引物对见表1。

表1 多重PCR引物序列信息Table 1 Sequences of primers in the multiplex PCR

2.2 多重PCR特异性实验

前期研究结果表明，大肠杆菌O157：H7 EC1、EC2、EC3、EC4、EC5 号菌株均携带两种志贺毒素和hlyA基因，多重PCR检测结果与之一致，3组引物扩增均能得到预期PCR产物，见图1。单核增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、普通大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等则呈阴性结果（图片未附），表明多重PCR特异性强。

2.3 多重PCR灵敏度实验

用纯菌DNA做多重PCR灵敏度验证试验，DNA浓度为1.88 ng/μL时，3组基因都能良好扩增出。DNA浓度持续降低，stx2、wzy引物对灵敏性下降，但hlyA基

2.4 人工染菌样品试验

当稀释度为10－5时，stx2、wzy基因有模糊的产物条带。稀释度为10－9时，仍可检测hlyA基因,对应平板菌落计数为平板菌落计数为1.2 cfu/mL。将3组基因均能获得良好扩增的对应稀释度作为检测的最高灵敏度，则多重PCR检测的最高稀释度为10－5。每个稀释度相应进行平板计数，稀释度为10－5时，平板菌落计数为 1.2×104cfu/mL。

3 结论

STEC的检测是一个难点，传统检测方法一般是通过平板分离出单菌落后，采用免疫试剂盒测定志贺毒素，或采用特异性核苷酸探针鉴定单菌落的stx基因[7]。STEC毒力复杂，大质粒上编码溶血素的hlyA基因、编码紧密粘附素的eae基因等，可增强STEC的毒力[7]。此种检测STEC的多重PCR技术，可同时检测stx2、hlyA两种毒力基因和wzy基因。O抗原聚合酶基因wzy基因是O157血清型大肠杆菌的特异基因，可鉴别出O157菌株。O157是STEC最主要的血清型，也是STEC最常见的引起食物中毒的血清型。通过扩增这三组基因，不仅可区分出O157，还可鉴定出菌株的毒力情况，为流行病学研究和食品安全控制提供更全面的信息。本文报道的多重PCR技术，能满足实际检验要求。多重PCR引物之间容易相互干扰，形成引物发夹环或引物二聚体，导致检测灵敏度降低。多重PCR体系中hlyA基因扩增优于另两组基因，可在后续试验中继续优化PCR体系和反应条件，以进一步提高stx2和wzy基因的检测灵敏度。

[1]Mainil J G,Daube G.Verotoxigenic Escherichia coli from animals,humansandfoods：who’swho[J].JApplMicrobiol,2005,98(6)：1332-1344

[2]Law D.Virulence factors of Escherichia coli O157 and other Shiga toxin-producing E.coli[J].J Appl Microbiol,2000,88(5)：729-745

[3]Eklund M,Scheutz F,Siitonen A.Clinical isolates of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli：serotypes,virulence characteristics,and molecular profiles of strains of the same serotype[J].J Clin Microbiol,2001,39(8)：2829-2834

[4]Eklund M,Leino K,Siitonen A.Clinical Escherichia coli strains carrying stx variants and stx-positive virulence profiles[J].J Clin Microbiol,2002,40(12)：4584-4593

[5]周勇,万成松.大肠杆菌O157：H7的毒力岛与毒力因子的研究进展[J].微生物学免疫学进展,2006,34(2)：58-62

[6]Wang G H,Clark C G,Rodgers F K.Detection in Escherichia coli of the genes encoding the major virulence factors,the genes defining the O157：H7 serotype,and components of the type 2 Shiga toxin family by multiplex PCR[J].J Clin Microbiol,2002,40(10)：3613-3619

[7]罗霞，徐建国.产志贺毒素型大肠杆菌的研究进展[J].疾病监测，2006，21(4)：217-220

A Multiplex PCR System for the Detection of Shiga Toxin-producing Escherichia Coli in Food

LI Rui,DAI Shi-jiao,YANG Jing-jing,QÜ Min，LIU Zhi-guo
（College of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei,China）

2010-04-13

李睿（1972—），女（土家），副教授，博士，现从事食品安全方向研究工作。