肖海峻，孟利前，杨新建，田锦，雷莉辉，曹允

（北京农业职业学院食品与生物工程系，北京102442）

苜蓿叶蛋白提取工艺参数优化试验

肖海峻，孟利前，杨新建，田锦，雷莉辉，曹允

（北京农业职业学院食品与生物工程系，北京102442）

以水为溶剂，采用热凝絮法分别研究水浴温度、水浴时间、苜蓿切碎长度、料液比、打浆时间、离心转速和离心时间对叶蛋白提取效果的影响；在单因素试验的基础上，采用7因素2水平正交试验对苜蓿叶蛋白提取工艺进行优化，试验结果表明，打浆时间、水浴时间、打浆的料液比、苜蓿切碎长度、水浴温度是影响苜蓿叶蛋白得率和蛋白质提取率的主要因素。其最佳提取工艺参数是：打浆时间5 min，水浴时间为12 min，打浆时料液比为1∶5，苜蓿切长为1 cm，水浴温度为80℃，离心时间10 min，离心转速为3000 r/min。该研究旨在探索苜蓿叶蛋白提取工艺参数优化试验，为大规模生产苜蓿叶蛋白提供参考。

苜蓿；提取工艺；叶蛋白

Abstract:Using water as extracting solvent,the extraction effects of water temperature and heating time,alfalfa mincing length,the radio of water to alfalfa,pulping time,centrifugal rev and time were studied respectively；based on the single factor experiment,the orthogonal experiment 7 factors and 2 levels were used to research the optimal extraction processing parameters of leaf protein from alfalfa，the results showed that main factors which had an effect on the extracting rate and the contents of of leaf protein were pulping time,heating time,the radio of water to alfalfa,alfalfa mincing length and water temperature.Based on the analysis of above,the optimal extraction processing parameters of leaf protein from alfalfa as follows：pulping time of 5 minutes,heating time of 12 minutes,the radio of water to alfalfa of 5,alfalfa mincing length of 1cm,water temperature of 80℃,centrifugal rev and time was 10 min and 3000 r/min.The aim of this paper was to provide an basis for mass production of leaf protein.

Key words：alfalfa；extraction processing；leaf protein

叶蛋白泛指以新鲜的青嫩茎叶为原料，经榨汁、絮凝、浓缩、干燥等工艺提取的一种富含蛋白质的浓缩物（leaf protein concentration 简称 LPC）[1]，由细胞质蛋白、叶绿体内的基质蛋白及部分线粒体蛋白组成的混合物[2]。

苜蓿叶蛋白具有产量高、凝聚颗粒大、易分离、品质好等特点，因而苜蓿是目前用于生产LPC的主要原料。苜蓿叶蛋白具有极高的营养价值，其氨基酸种类齐全而且组成比例较为平衡[3]，与联合国粮农组织推荐的成人氨基酸模式基本相符,可作为儿童和成人的食用蛋白源和食品添加剂；苜蓿还具有极高的饲用价值，用苜蓿叶蛋白取代猪、家禽日粮中的部分乃至全部蛋白质饲料或取代哺乳犊牛的部分全乳代用品时,都能取得良好的饲养效果[4]；此外，苜蓿还具有抗衰老、抗肿瘤、治疗关节炎、心血管病、肺气肿、老年性白内障等功效。叶蛋白提取之后的残渣可直接作为饲料喂养家畜。由此可见，从苜蓿中提取叶蛋白不仅可以缓减当前蛋白饲料资源短缺的局面，也是牧草深加工和综合利用的有效途径[5]。

近年来，对叶蛋白提取工艺参数的研究主要集中在料液比、汁液的pH、保温的温度及时间等方面[6-8]。在此基础上又增加苜蓿切碎长度、离心转速、离心时间及水浴时间等参数进行研究，考察蛋白质提取工艺参数对叶蛋白得率及蛋白质提取率的影响，以获得叶蛋白提取最佳工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料

紫花苜蓿，2008年5月种植于北京市大兴区榆垡镇，2009年6月份采集，清洗后于-5℃冷冻储藏，测定其含水量为69%，粗蛋白含量为22.3%。

1.2 仪器

FA-2004N电子分析天平、pHS-3C酸度计：上海精密科学仪器有限公司；A-88组织捣碎匀浆机：金坛市医疗仪器厂；LD4-2低速离心机：北京医用离心机厂；SM-3X恒温干燥箱：上海神模电气有限公司；8002型恒温水浴锅：北京光明医疗机械厂。

1.3 方法

1.3.1 叶蛋白提取工艺

准确称取一定数量的苜蓿，将其切碎并按一定比例加水，用打浆机打浆，用2层纱布过滤，将得到的滤液在设置温度下加热凝絮，经离心得到沉淀物叶蛋白，在烘箱65℃条件下烘干得到叶蛋白提取物，称其质量，具体的工艺流程如图1。

图1 叶蛋白提取工艺流程图Fig.1 Technical process of extraction leaf protein from alfalfa

1.3.2 叶蛋白提取工艺考核指标

以叶蛋白得率及蛋白质提取率2个指标对叶蛋白提取工艺条件进行研究，其计算公式[2]分别是：

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验

1.4.1.1 水浴温度对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响

水浴时间10 min，苜蓿切长为2 cm，打浆时料液比为 1∶6（g/mL），打浆时间为 5 min，离心转速为3000 r/min,离心时间为10 min，水浴温度分别为60、70、80、90、100℃时测定苜蓿叶蛋白得率和蛋白质提取率。

1.4.1.2 水浴时间对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响

水浴温度为80℃，苜蓿切长为2 cm，打浆时料液比为 1∶6（g/mL），打浆时间为 5 min，离心转速为3000 r/min,离心时间为10 min，水浴时间分别为4、6、8、10、12 min时测定苜蓿叶蛋白得率和蛋白质提取率。

1.4.1.3 苜蓿切碎长度对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响

水浴温度为 80 ℃，打浆时料液比为 1∶6（g/mL），打浆时间为5 min，离心转速为3000 r/min,离心时间为10 min，苜蓿切长分别为 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 cm 时测定苜蓿叶蛋白得率和蛋白质提取率。

1.4.1.4 打浆时料液比对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响

水浴温度为80℃，苜蓿切长为2 cm，打浆时间为5 min，离心转速为3000 r/min,离心时间为10 min，水浴时间为 10 min，料液比分别是 1∶5、1∶6、1∶7 和1∶8（g/mL）时测定苜蓿叶蛋白得率和蛋白质提取率。

1.4.1.5 打浆时间对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响

水浴温度为80℃，苜蓿切长为2 cm，离心转速为3000 r/min,离心时间为10 min，水浴时间为10 min，料液比为 1∶6（g/mL），打浆时间分别为 3、5、7 min 时测定苜蓿叶蛋白得率和蛋白质提取率。

1.4.1.6 离心转速对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响

水浴温度为80℃，苜蓿切长为2 cm，离心时间为10 min，水浴时间为 10 min，料液比为 1∶6（g/mL），离心转速分别为2000、3000、4000 r/min时测定苜蓿叶蛋白得率和蛋白质提取率。

1.4.1.7 离心时间对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响

水浴温度为80℃，苜蓿切长为2 cm，水浴时间为10 min，料液比为 1∶6（g/mL），离心转速为 3000 r/min,离心时间分别为5、10、15、20 min时测定苜蓿叶蛋白得率和蛋白质提取率。

1.4.2 正交试验

在单因素试验研究的基础上，选用水浴温度、水浴时间、苜蓿切碎长度、料液比、打浆时间、离心转速、离心时间7个参数进行L8(27)正交试验，具体的正交试验方案见表1；在该试验中分别选用叶蛋白得率及蛋白质提取率对叶蛋白提取工艺条件进行分析，每一水平重复3次。

表1 叶蛋白提取试验因素与水平Table 1 Factors and levels of extraction experiments of LPC

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 水浴温度对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响水浴温度对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响见图2。

从试验结果（见图2）可以看出，随着温度的升高，叶蛋白得率及蛋白质提取率在增加，当水浴温度为80℃时，叶蛋白得率及蛋白质提取率均达到最大，此时再增加温度，提取率的变幅不大，因此确定该试验中水浴温度为80℃。

2.1.2 水浴时间对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响水浴时间对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响见图3。

从图3可以看出，随着水浴时间的延长，叶蛋白得率的量在增加，当水浴时间超过10 min后，叶蛋白得率的量在减少，而蛋白质提取率随着水浴时间的延长在不断增加，但超过10 min变幅不大，从降低成本的角度考虑，水浴时间应该选10 min。

2.1.3 苜蓿切碎长度对叶蛋白得率的影响

苜蓿切碎长度对叶蛋白得率的影响见图4。

从图4可以看出，当苜蓿切碎长度从0.5 cm逐渐加长时，叶蛋白得率及蛋白质提取率随着增加，当切碎长度超过2 cm时，叶蛋白得率和蛋白质提取率下降。随着切碎长度的增加，苜蓿在打浆过程中的破碎程度逐渐降低，导致蛋白质不能全部溶解出来，最终导致提取率降低。

2.1.4 打浆时料液比对叶蛋白得率的影响

打浆时料液比对叶蛋白得率的影响见图5。

从图5可以看出，叶蛋白得率及蛋白质提取率随着料液比的增加而减少，在料液比为1∶5（g/mL）到1∶7（g/mL）之间变幅较小，从成本的角度考虑，料液比应该选定为 1∶5（g/mL）更适宜。

2.1.5 打浆时间对叶蛋白得率的影响

打浆时间对叶蛋白得率的影响见图6。

从图6可以看出，打浆时间为5 min时，叶蛋白得率及蛋白质提取率均获得最大值，在5 min以前，由于打浆时间短，细胞没有充分破碎，因此获得的蛋白质量很少，当打浆时间超过5 min时，也可能由于打浆时间的延长，对蛋白质结构的破坏也随着增加，因此也会造成蛋白质数量减少。

2.1.6 离心转速对叶蛋白得率的影响

离心转速对叶蛋白得率的影响见图7。

从图7可以看出，叶蛋白得率和蛋白质提取率随着转速的增加而增加，当离心转速达到4000 r/min时，这2个指标达到最大，因此在提取过程中可以选择4000 r/min。

2.1.7 离心时间对叶蛋白得率的影响

离心时间对叶蛋白得率的影响见图8。

从图8可以看出，离心时间从5 min增加到10 min时，叶蛋白得率及蛋白质提取率变化较大，超过10 min时，两者的增幅变化不大，因此可确定离心时间为10min。

2.2 正交试验

2.2.1 以叶蛋白得率为指标对叶蛋白提取工艺进行分析

正交试验方案及结果分析和方差分析结果见表2、表3。

表2 试验方案及结果分析Table 2 Experiment project and analysis results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

从表3可以看出，因素主次顺序为：E-B-D-C-AG-F，对因素 E、B、D、C、A、G 和 F 进行分析，确定优水平为E2B2D1C2A1G1F2，即打浆时间为5 min，水浴时间为12 min，打浆时料液比为1∶5 g/mL，苜蓿切长为1 cm，水浴温度为80℃，离心时间10 min，离心转速为3000 r/min为最优方案。

2.2.2 以蛋白质提取率为指标对叶蛋白提取工艺进行分析

正交试验结果分析和方差分析结果见表4、表5。

表4 试验方案及结果分析Table 4 Experiment project and analysis results

表5 方差分析表Table 5 Analysis of Variance

由表5可以看出，因素主次顺序为：E-B-D-A-CF-G，由表 2对因素 E、B、D、A、C、F 和 G 进行分析，确定优水平为E2B2D1A1C2F2G1，即打浆时间为5 min，水浴时间为12 min，水浴温度为80℃，打浆时料液比为1∶5（g/mL），苜蓿切长为 1 cm，离心转速为 3000 r/min,离心时间为10 min为最优方案。

在所选的7个参数中，打浆时间对叶蛋白得率和蛋白质提取率的影响最大，这充分表明了细胞的破碎程度是影响着蛋白质提取的重要因素，因此在提取蛋白的过程中，一定要把细胞充分破碎，是获得高提取率的前提，打浆时间的长短会影响其破碎程度。

其次为水浴时间和料液比，这也是影响蛋白提取率的2个因素。随着水浴时间的延长，叶蛋白得率及蛋白质提取率在不断增加，但也要注意不能水浴时间太长，否则会提升成本；随着料液比增加时，叶蛋白得率及蛋白质提取率在降低，当料液比很低时会导致浸提不充分，从而影响提取效果，但当料液比很高时，造成浓度很稀，蛋白质凝集性差，也会造成蛋白质提取效果不好的局面。

再次，对叶蛋白提取效率影响最小的2个因素是离心时间和离心转速，这可能与苜蓿叶蛋白凝聚颗粒大、易分离等特点有关，因此，为降低成本，可选用较低的转速和较短的离心时间。

3 结论

从以上分析可以看出，采用叶蛋白得率及蛋白质提取率这2个指标对叶蛋白提取最佳工艺条件进行分析的结果较为一致，因此确定打浆时间为5 min，水浴时间为12 min，水浴温度为80℃，打浆时料液比为1∶5（g/mL），苜蓿切长为 1 cm，离心转速为 3000 r/min，离心时间为10 min为苜蓿叶蛋白最佳提取工艺条件。

[1]张艺,李忠.植物叶蛋白的开发应用[J].食品研究与开发,2004,25(5)：102-105

[2]吴万灵，韩鲁佳,王唯涌.苜蓿叶蛋白提取工艺参数优化实验研究[J].中国农业大学学报，2006，11(5)：65-69

[3]高岩.苜蓿叶蛋白及其开发应用[J].中国饲料，1991,5(1)：14

[4]韩春梅,张新全,杨春华,等.苜蓿叶蛋白的开发利用现状[J].草业科学,2005,22(9)：23-27

[5]田丽萍，刘广青.苜蓿利用及深加工技术研究进展[J].草食家畜，2004，6(2)：39-41

[6]饶国华，赵谋明，林伟峰，等.低次烟叶蛋白质提取工艺研究[J].西北农林科技大学学报：自然版，2005，33(11)：67-72

[7]赵谋明，饶国华，林伟峰，等.低次烟叶中蛋白质提取工艺优化及氨基酸分析研究[J].农业工程学报，2006，22(1)：142-146

[8]田少君，张磊.烟叶叶蛋白的提取研究[J].食品科技，2005(5)：15-17

Experimental Study on Parameter Optimization of Extraction Process of Leaf Protein from Alfalfa

XIAO Hai-jun,MENG Li-qian,YANG Xin-jian,TIAN Jin，LEI Li-hui,CAO Yun
（Department of Food and Bioengineering，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442,China）

2010-06-20

北京市教委科技计划面上项目（KM200900005007）-苜蓿叶蛋白提取技术研究

肖海峻（1966—），女（汉），副教授，博士，研究方向：植物种质资源的开发与利用。