贺东生，林小敏，苏丹萍,罗满林，林绍荣

(华南农业大学兽医学院，广东广州， 510642）

口蹄疫病毒R株致弱前后的基因变异研究

贺东生，林小敏，苏丹萍,罗满林，林绍荣

(华南农业大学兽医学院，广东广州， 510642）

为研究口蹄疫病毒(FMDV）致弱前后基因组变化的关系，本研究根据GenBank上发表的口蹄疫病毒全基因序列数，设计了8对引物，采用RT-PCR方法分别扩增出FMDV R株及其致弱毒株(R304）编码区的8段基因，将各片段克隆至pMD18-T载体，并进行序列测定。比较和分析编码区各个基因(LP、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）的核苷酸序列和氨基酸序列的变异。结果表明，R株和R304株基因组区全长均为6 966 nt，编码2 322个氨基酸，致弱后共有110个核苷酸发生变化，编码氨基酸有32个发生变化；其中3A基因的氨基酸序列变化最大，其次为LP和VP1，而2A和2C的氨基酸未发生变异。该研究对口蹄疫病毒的抗原和毒力研究有重要的参考价值。

口蹄疫病毒；减毒；基因；变异

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD）是偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病，传播迅速、感染率高，往往形成大范围流行，被国际兽疫局(OIE）列为A类动物疫病之首。该病原为FMD病毒(FMDV），属于微RNA病毒科(Picornaviridae）口蹄疫病毒属(aphthovirus），有7个血清型，型间无交叉反应。完整病毒含有RNA、衣壳蛋白和少量的非结构蛋白和宿主细胞肌动蛋白。基因组为单股正链RNA，全长约8.5 kb，由5'非翻译区(UTR）、3'UTR和一个开放阅读框架(ORF）组成。5'UTR长约1 300碱基，含有VPg(3B）蛋白、S片段、特殊的100碱基～200碱基的poly(C）区段、功能未知区(FUR）和内部核糖体进入位点(IRES）。3'UTR由一段长约90碱基的核苷酸序列和poly(A）尾巴组成。ORF长约6.5 kb，由L(引导蛋白）、P1结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成，以L、P1、P2和P3的顺序依次排列，编码一聚合蛋白，该聚合蛋白随后逐级被降解为病毒所需的各个组分L/L'、P1(1A、1B、1C和1D，即VP4、VP2、VP3、VP1）、P2(2A、2B 和 2C）和 P3(3A、3B、3C 和 3D）[1]。

本研究根据口蹄疫病毒的全基因序列，设计了多对特异性引物，用RT-PCR方法获得各基因片段，并进行克隆、序列测定，首次揭示了口蹄疫病毒连续传代致弱后的基因变异情况，为该病毒基因组的结构和功能的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 病毒株 FMDV R株，为猪的O型口蹄疫强毒，R株经钴60照射并在雏鸡传304代的弱毒为R304株，由本院家畜传染病教研室保存。

1.2 实验材料 大肠杆菌DH5α菌株由本教研室保存；总RNA抽提试剂TRIzol为北京塞白盛生物工程有限公司产品；反转录酶M-MLV为日本TOYOBO公司产品；PCR所用试剂、限制性内切酶和pMD18-T载体均为TaKaRa公司产品；胶回收试剂盒、质粒回收试剂盒均为Omega公司产品。

1.3 引 物 参考GenBank中的FMDV全基因序列(AY317098，AY593813，AY593817，AF026168，AJ539136）设计覆盖了整个基因组编码区的8对特异性引物(表1），两个相邻片段之间有部分重叠(图1）。

1.4 病毒总RNA的提取 病毒总RNA的提取，在生物安全三级(BSL3）实验室内参照TRIzol试剂使用说明书进行。

1.5 RT-PCR扩增各基因片段 以病毒RNA为模板，采用下游引物，按照反转录操作说明书的方法进行cDNA合成。然后以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体积为100 μL，其反应条件为：95℃4 min，95℃40 s、55℃1 min、72℃1 min、30个循环，最后72℃10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，用Omega胶回收试剂盒回收。

1.6 各基因片段的克隆和序列测定 回收片段经加A尾反应后与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中，用氨苄抗性筛选出带有阳性重组质粒的单菌落后，菌液经PCR鉴定为阳性，用Omega质粒抽提试剂盒抽提质粒进行HindⅢ、BamHⅠ双酶切鉴定。鉴定为阳性的菌液送到上海博亚生物技术公司进行测序，将各基因序列进行拼接。

表1 扩增基因组编码区的各对引物序列Table 1 Primer sequences for FMDV gene amplification

1.7 基因组测序 用软件DNAStar5.0推导相应编码的氨基酸序列，并比较强弱毒株各基因的核苷酸序列和氨基酸序列的差异。

2 结果与讨论

经过重复性扩增和序列分析后，确定FMDV强、弱毒株的编码区从起始密码子ATG到终止密码子TAA前的长度均为6 966 nt，编码2 322氨基酸。强弱病毒各基因及其推导氨基酸的长度如表2所示。致弱前后各基因的核苷酸及其编码氨基酸变异情况如下：LP基因长603 nt，编码201个氨基酸，致弱后14个碱基发生突变，推导的氨基酸5个发生突变(Q26H、H95R、I115T、M126V、E165G）；VP4基因长255 nt，编码85个氨基酸，致弱后4个碱基发生突变，推导的氨基酸2个发生突变(G10E、K70R）；VP2基因长654 nt，编码218个氨基酸，致弱后11个碱基发生突变，2个氨基酸发生突变(N134K、L142P）；VP3基因长 660 nt，编码 220个氨基酸，致弱后13个碱基发生突变，2个氨基酸发生突变(S70P、S158P）；VP1基因长 633 nt，编码211个氨基酸，致弱后8个碱基发生突变，5个氨基酸 发 生 突 变 (P65L、 T68A、 D138G、 T152A、E156K）；2A基因长54 nt，编码18个氨基酸，致弱后2个碱基发生突变，氨基酸未变化；2B基因长462 nt，编码154个氨基酸，致弱后9个碱基发生突变，11个氨基酸发生突变(T17I、I18V、I128T）；2C基因长954 nt，编码318个氨基酸，致弱后12个碱基发生突变，氨基酸没有变化；3A基因长429 nt，编码143个氨基酸，致弱后12个碱基发生突变，7个氨基酸发生突变(E37K、T51A、E78G、P119L、E138G、R141Q、A142T）；3B基因长 213 nt，编码71个氨基酸，致弱后3个碱基发生突变，1个氨基酸发生突变(N66D）；3D基因长1 410 nt，编码470个氨基酸，致弱后15个碱基发生突变，2个氨基酸发生突变(V13I、P113S）。

表2 FMDV强弱毒株基因及其推导氨基酸序列的变异Table 2 Mutation of nucleotide acid and deduced amino acid sequence of FMDV R and R304 strain

FMDV结构蛋白结构和功能的关系。研究已表明，VP1编码1D蛋白，它暴露于病毒的表面，是决定病毒抗原性的主要部分，1B、1C、1D位于衣壳表面，为外衣壳蛋白。分离后仅1D能使机体产生抗病毒的中和抗体，但4种结构多肽都参与免疫原性的产生，不同血清型病毒的抗原位点有所不同[2]。O型病毒有5个位点，其中3个位于VP1基因上，抗原位点1由1D G-H环(133 aa～157 aa和200 aa～213 aa）的线性表位组成，该位点是FMDV最重要的抗原位点，也是FMDV抗原变异的关键区域，G-H环还具有诱导中和抗体并与中和抗体相互作用的双重功能。已经证明，某些氨基酸的突变会影响病毒的抗原性，称为关键氨基酸，抗原位点1的关键氨基酸为 V144、L148、K154、P208，抗原位点 3位于VP1的βB-C环上，其关键氨基酸为T43和P44；抗原位点5位于VP1 G-H环内，其关键氨基酸为Q149[3]。另外，在145 aa～148 aa为高度保守的RGDL基序。RGD是一种细胞表面受体分子识别基序。FMDV可以通过对精氨酸－苷氨酸－天冬氨酸(RGD）基序识别细胞表面的整联体分子而吸附在细胞表面[4]。实验结果表明R株致弱后VP1蛋白中虽然有5个氨基酸发生了改变，但在关键的免疫原性位点(145 aa～148 aa）没有发生变化，仍为保守的RGDL结构，提示致弱后的FMDV R304株保留有较好的抗原性，这与早期进行的该毒株生物学特性的研究结果相符。

另外，FMDV非结构蛋白结构和功能的关系。FMDV L蛋白有两种形式Lab和Lb，这是由于核糖体可在相距84个碱基的两个AUG起始不同阅读框架进行翻译的结果，其中两个AUG相比，第二个AUG具有真核核糖体识别有效起始翻译的特征性序列AXX AUG G[5]。L蛋白具有蛋白酶活性，参与关闭宿主细胞的蛋白合成，是病毒致病和传染的必需基因，氨基酸C51、H148和D164是L蛋白酶的活性中心。有研究还表明，L蛋白发挥作用的形式有两种，分别为分子内切割和分子间切割。而残基VQK(K或R）LKGAGQS在所有FMDV血清型中均保守，但哪个残基为切割所必需仍不清楚[6]。本研究测序结果表明R株致弱前后两个起始密码子的位置并没有改变，而3个活性中心氨基酸也没有发生变化。在强弱毒株的L蛋白最后5个氨基酸和VP4蛋白的前5个氨基酸均可以找到保守的VQKRLK和GAGQS基序。

非结构蛋白P2中的2AB/C与病毒诱导细胞病变有关，2B能增强膜通透性、封闭蛋白酶分泌的途径，2C具有ATP和GTP酶的活性，2A和2C都高度保守[7-8]。有研究表明2C的中央区包含核苷三磷酸(NTP）结合蛋白的特征性基序，AGXXXGKS/T，参与同NTP磷酸基的结合[9-10]。本研究的R株致弱后两个蛋白的推导氨基酸序列均没有变化，但在中央区并没有找到该特征性基序，而在第110位有GKSGQGKS序列。

P3中3A高度保守，其变异与宿主范围改变有关；研究表明，口蹄疫所在科属病毒的3B蛋白都是通过保守的第3位酪氨酸残基连接到RNA上的[11]；3C具有蛋白酶活性，参与关闭宿主细胞的转录和翻译；3D为依赖于RNA的RNA聚合酶，与已知的所有DNA和RNA聚合酶具有同源性，3D中有一个高度保守的以两个天冬氨酸残基为中心的氨基酸疏水区基序YGDD[12]。本研究中强弱毒株推导的氨基酸序列3B第3位均为保守的酪氨酸Y。强弱毒株的序列分析表明3A的氨基酸序列变化最大，同样属于缺失10个氨基酸的猪流行株，推导出的143氨基酸中，致弱后7个发生突变，主要发生在3A基因的后半部分，突变的位置没有明显的规律性，均为间断性的点突变，这可能与该毒株长期传代和适应新宿主有关。

本研究对FMDV R株及其致弱毒株R304分别进行了全基因组序列的测定及分析，结果表明：致弱后R304株2A和2C的氨基酸序列都没有发生变化，而3A的氨基酸序列变化最大，这可能与FMDV长期传代致弱有关；其次，LP和VP1的氨基酸变化也相对较大，但VP1上的几个重要的抗原位点都没有变化，提示致弱后病毒可能仍保留较好的抗原性。

本研究首次报道了长期传代致弱FMDV的基因组变化与功能的潜在关系，从基因水平上揭示了FMDV的变异趋势和进一步致弱改良的潜能，对FMDV的分子流行病学和功能基因组学有重要的参考价值。

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Sequence analysis and comparison for genome of Foot-and-mouth disease virus R strain and its chickling-attenuated strain

HE Dong-sheng,LIN Xiao-min,SU Dan-ping,LUO Man-lin,LIN Shao-rong

(College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

In this study,eight DNA fragments covered the full elngth genome of Foot-and-mouth disease virus R strain and its attenuated variant were amplified by RT-PCR using specific primers.Each fragment was cloned to pMD18-T vector and sequenced.The results showed that the genome of R strain and the attenuated strain shared the same ORF of 6 966 nt which encoded for 2322 amino acid.However,there were 110 nucleotides and 32 amino acids changes in the attenuated strain,of which the 3A gene mutated most frequently,followed by the LP gene and VP1 gene ranged third.No mutations occurred in 2A gene and 2C gene.

FMDV;attenuated;genes;mutation

S852.65

A

1008-0589(2010）03-0221-04

*Correspondingauthor

2009-06-29

广东省科技厅攻关项目(2003A20403）；广东省农业厅粤农[2004]314号项目

贺东生(1968-），男，广西贺州人，博士，从事兽医传染病学研究.Email：dhe@scau.edu.cn

(本文编辑：陈立群）