李霞

（湖南省湘潭市第二人民医院药剂科，湖南湘潭 411100）

四黄泻火片、麻仁丸中非法添加土大黄苷检测方法的建立

李霞

（湖南省湘潭市第二人民医院药剂科，湖南湘潭 411100）

目的：建立四黄泻火片、麻仁丸中非法添加土大黄的检测方法。方法：采用薄层色谱法（TLC）结合高效液相色谱法（HPLC）快速鉴别。结果：该薄层色谱法鉴别法（TLC）加高效液相色谱法（HPLC）稳定性和重复性好。结论：TLC结合HPLC简便、快速、专属性强，能有效地检查四黄泻火片、麻仁丸中是否掺入土大黄。

四黄泻火片；麻仁丸；土大黄苷；薄层色谱法；高效液相色谱法

四黄泻火片、麻仁丸中均含有大黄成分，按照标准检验[1-3]，结果符合规定，但在检验过程中，发现薄层斑点异常，研究其处方成分并调用参照样品进行阴性对照，怀疑该品种掺入了土大黄。土大黄主要成分是土大黄苷。土大黄苷为二苯乙烯的衍生物，存在于劣质大黄中[4-5]。为了有效杜绝掺伪，本文建立了快速筛查四黄泻火片、麻仁丸是否非法掺伪土大黄的薄层鉴别方法，并用HPLC法予以确证。

1 仪器与试药

1.1 仪器和设备

岛津LC-20A高效液相色谱仪，SPD－M20A检测器，LC-solution色谱工作站，梅特勒-托利多AG135型天平（德国Sartorius），CTO－10AS 柱温箱，KQ2200E 型超声波清洗器；10×20 cm硅胶G薄层层析板（青岛海洋化工厂分厂，20081211）[6-7]。

1.2 试剂

乙腈为色谱级；其他试剂为分析纯；纯化水（自制）。

1.3 试药

供试品：四黄泻火片，麻仁丸。

参照样品粉末：按标准中提供的处方及制法制备。阴性样品粉末：按标准中提供的处方，去大黄后依法制备。土大黄苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号794-200103）。

2 方法与结果

2.1 TLC法

2.1.1 溶液的配制

阴性样品溶液的制备：取阴性样品粉末约1 g，照供试品溶液的制备项下的方法制备。

参照样品溶液的制备：取参照样品粉末约1 g，照供试品溶液的制备项下的方法制备。

对照品溶液制备：精密称取土大黄苷对照品1 mg，加甲醇5 ml使溶解，制成浓度0.2 mg/ml的溶液。

2.1.2 薄层色谱条件

硅胶G薄层层析板（10×20 cm）；展开剂：三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）；点样量：10 μl；温度：24℃；相对湿度：52%。 三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开后，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。

2.1.3 方法

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μl，观察。

2.1.4 试验结果

抽屉原理是将需要讨论的元素按一定特质分类，当取出足够多的元素时，再运用抽屉原理将范围缩小，从而推导出属于同一类的某几种元素，它们均同时具备某种特质，由此推导出题目的结论。运用抽屉原理时通常会出现以下几个特点：第一、题目中所讨论的元素具备任意性；第二、题目的结论至少要有一类是具备某种特质的，是一个存在性命题；第三、结论不需要确定，但需存在。

四黄泻火片与麻仁丸供试品溶液所显主斑点的颜色呈亮蓝色，与土大黄对照品溶液的一致；测定斑点位置时，RF为0.65，与土大黄对照品一致。而参照样品溶液所显主斑点的颜色和位置与土大黄苷对照品溶液的不一致（图1），提示四黄泻火片与麻仁丸可能均掺入土大黄。

2.2 HPLC法

2.2.1 溶液的制备

供试品溶液的制备：取四黄泻火片10片，除去包衣，称定重量，研细，混匀，（或取麻仁丸适量，剪碎），精密称取0.5 g，置锥形瓶中。加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇补充减失重量，混匀，滤过用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

图1 四黄泻火片与麻仁丸片的TLC图

对照品溶液制备：精密称取对照品8 mg于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

阴性样品溶液的制备：精密称取阴性样品粉末0.5 g,照供试品溶液的制备项下的方法制备。

参照样品溶液的制备：精密称取对参照样品粉末0.5 g，照供试品溶液的制备项下的方法制备。

2.2.2 色谱条件

色谱柱：资生堂 CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(18∶82)为流动相，检测波长 324 nm，流速为1.0 ml/min，进样量：10 μl，柱温：35℃，理论板数土大黄苷峰计算应不低于3 000[1]。土大黄苷峰与各杂质峰分离度均应大于2。自动进样。

2.2.3 结果

分别取对照品溶液、供试品溶液，阴性样品溶液，参照样品溶液各10 μl进样测定。结果表明：供试品溶液中主峰保留时间与土大黄苷对照品溶液的色谱峰保留时间一致，通过DAD检测进一步检测，主峰与土大黄苷峰的DAD（紫外光谱图）一致且杂质不干扰样品测定，而参照样品溶液在土大黄苷对照品主峰相应保留时间未出现色谱峰。对照品溶液、供试品溶液色谱图见图2，DAD光谱图见图3。

2.2.4 方法学

2.2.4.1 精密度试验色谱条件：精密吸取土大黄苷对照品溶液10 μl，连续进样7次，记录对照品色谱峰保留时间，分别为12.585、12.563、12.546、12.523、12.489、12.496、12.501 min，RSD为0.3%，结果表明，进样精密度良好。

2.2.4.2 最低检出限的测定：精密吸取土大黄苷对照品溶液，并释释至刻度，摇匀，精密吸取1 ml，置100 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。照上述色谱条件，进样5 μl，记录色谱图，结果信噪比为S/N为13∶1时，最低检出限为 4×10-3μg，信噪比为S/N为3∶1时，最低检出限为0.916×10-3μg。

3 讨论

为了测定土大黄苷的含量，流动相采用甲醇-乙腈-水溶液（用磷酸调节 pH3.5）（35∶5、60），乙腈-0．1%磷酸溶液（加入0．1%三乙胺）（20∶80），乙腈-水（18∶82），经过试验，采用乙腈-水（18∶82）检出的色谱峰最理想，土大黄苷色谱峰能达基线分离。理论板数为16 000。供试品土大黄苷色谱峰与其他质谱分离度大于2.0。故选此系统作为流动相进行实验。

图2 HPLC色谱图

供试品的提取溶剂及方法的考察，分别采用乙酸乙酯、乙腈、甲醇作为溶剂的考察，结果以甲醇为提取溶剂提取30 min效果最好。

测定波长的选择：在高效液相色谱条件下，利用二极管陈列检测器对土大黄苷对照品在200～400 nm波长范围内进行扫描，结果土大黄苷在219 nm、324 nm波长处均有最大吸收，其中324 nm响应植最高且波长适中，确定324 nm为检测波长。

判断标准：薄层；供试品色谱中，在供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，不得显相同颜色的荧光斑点。若出现相同颜色的荧光斑点，则用下列高效液相色谱法验证。在液相色谱图中，应不得出现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰。若出现可以判断为不合格。

实验结果表明，本方法采用TLC结合HPLC法相结合检测手段，用于筛查和检测四黄泻火片、麻仁丸是否掺入土大黄，保证人民用药安全。

[1]国家药典委员会.中国药典2005年版[M].一部北京:化学工业出版社,2005:384.

[2]国家药品监督管理局.中成药地方标准上升国家标准部分内科脾胃分册[S].WS-10940（ZD-0940）-2002.

[3]王启砚.HPLC法测定麻仁丸中大黄素和大黄酚的含量[J].中国药师,2006,9(7):622-623.

[4]卢兖伟.金钱草与土大黄有效成分研究与应用[D].北京:中国人民解放军军事医学科学院,2003.

[5]马锦星.补充检验方法和项目是打击药品掺杂、掺假行为的有效手段[J].中国药事,2004,18(3):158.

[6]罗一,李林松.四黄泻火片、麻仁丸中非法添加土大黄检查方法的建立[J].中国实用医学杂志,2010,20(4):59.

[7]刘艳,张勤.妇炎康胶囊中非法添加化学药品的快速检测[J].中国药师,2010,13(6):887-888.

Establishment of a method of determining Rhaponitin in Sihuang Xiehuo tablets and Maren pill

LI Xia
(Pharmaceutical preparation section,the Second People's Hospital of Xiangtan,Hunan Province,Xiangtan 411100,China)

Obiective:To establish a method for the identification of rhaponitin in Sihuang Xiehuo tablets and Maren pill.Methods:Both the HPLC and TCL were employed to identify..ResultsThe method of TLC combimed with HPLC had good stability and repeatability.Conclusion:The method is convenient,fast and selective,can identify the Rhaponitin in Sihuang Xiehuo tablets and Maren pill effectively.

Sihuang Xiehuo tablets;Maren pill;Rhaponitin;TLC;HPLC

R943.1

B

1674-4721（2010）12（a）-052-02

2010-10-14）