孙仁山，隋建峰，李 凤，唐书谦，吴先林，杨 涛，赵莉蓉，伍津津，李文维，雷 霞，冉新泽，郑晓莉，杨桂红，周金铃

(第三军医大学:1.大坪医院野战外科研究所皮肤科，重庆 400042;2.基础部医学试验中心 400038;3.预防医学院复合伤研究所，重庆 400038)

大部分慢性荨麻疹患者找不到明确的过敏原及病因。部分患者血清存在组胺释放活性，这种组胺释放活性是由自身抗体所致，大部分为抗高亲和力 Ig E受体(FcεR1)自身抗体，少部分为抗Ig E或其他抗体[1-9]。自身血清皮肤试验(autologous serum skin test，ASST)、嗜碱粒细胞组胺释放试验和嗜碱粒细胞活化试验(Basophilactivation test，BAT)可以对上述的自身抗体进行检测。嗜碱粒细胞活化后，CD63分子表达增强，并从细胞内转移至细胞表面，很多文献以CD63分子的表达为BAT检测指标，但CD63除在肥大细胞和嗜碱粒细胞表达外，在血小板及单核细胞等均可表达[10]。CD203c分子特异性地表达在肥大细胞和嗜碱粒细胞表面，本研究探讨以CD203c分子为BAT的观察指标，判断慢性荨麻疹外周血清对嗜碱粒细胞的活化情况，并以求判断慢性荨麻疹的自身免疫性质。

1 资料与方法

1.1 病例与分组 按文献[11-12]选择本科室(2010年1月至2010年6月)来就诊的慢性荨麻疹患者，随机选取ASST阳性患者血清26例(A组)、ASST阴性患者血清24例(B组)和健康对照血清20例(C组)。

1.2 试剂与仪器 抗人 CD203cPE、CRTH 2-FITC及CD3Per-CP为美国eBioscience公司产品，其他试剂均为进口或国产分析纯，流式细胞仪为美国BD公司产品，激光共聚焦显微镜为德国LEICA公司产品;光学显微镜为日本Nikon产品。

1.3 实验方法

1.3.1 标本处理及嗜碱粒细胞悬液制备 从1个健康自愿者肘静脉采血30 m L，肝素抗凝备用。每批标本均设阴性和阳性对照，在阳性对照管中加入经磷酸盐缓冲液(PBS)1∶10稀释的0.4 mmol FMLP 100μL，阴性对照管中以PBS 100μL替代FM LP，在检测管中加入100μL待检测血清，各管中加入肝素抗凝全血100μL，37℃水浴15 min，随后用含依地酸(EDTA，0.02 mol/L)的PBS 2 m L终止反应，离心弃上清液，加入CRTH 2-FITC/CD203c-PE/CD3Per-CP预混合的单克隆抗体15μL，置室温10 min后用溶血素处理10 min，以溶解红细胞，继用含0.1%牛人血清蛋白的PBS 2 m L洗涤2次，加PBS 700 μL重悬待用。

1.3.2 检测分析 每次检测前均用Flow Check荧光微球Beckman Coulter校准仪器，标本上机后，先以前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)参数大致观察细胞形态。然后在CD3和SSC双参数点图上选取排除了CD3阳性的有核细胞，排除细胞碎片和杂质。在CD203c和C RTH-2双参数点图上选取有核细胞中CD 203c阳性的细胞。将纯的嗜碱粒细胞用CD203c参数图进行分析，以未激活阴性为对照，观察CD203c抗原表达上调比例和幅度。以CD 203c表达上调细胞数的比例达到10%作为嗜碱粒细胞脱颗粒试验阳性的判断标准。染色细胞样品在流式细胞仪上用Cellquest软件进行检测，经Cellquest或Win MDI2.8软件分析，获取直方图，以平均免疫荧光强度(MFI)表示表达强度。

1.4 统计学处理 应用S PSS13.0软件进行统计数据分析，计量资料以表示，采用方差分析和 Anova检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 见表1。

表1 慢性荨麻疹患者血细胞CD203c表达结果()

表1 慢性荨麻疹患者血细胞CD203c表达结果()

*:P＜0.01，与 B、C 组比较。

组别 n CD203c表达百分率(%) C D203c表达强度(MFI)A 组 26 91.24±6.22* 58.2±12.55*B组 24 3.33±1.24 3.70±1.32 C组 20 3.05±1.07 3.20±1.29

3 讨 论

慢性特发性荨麻疹患者血清中能发现功能性抗FcεRI或抗Ig E自身抗体，这些患者HLA-DR等位基因频次增多，这种现象是自身免疫性疾病的特征。有研究表明，在具有自身抗体的慢性荨麻疹组，有充分的证据证明它们具有致病性，自身抗体的血浆水平与疾病活动性有密切的联系;清除自身抗体可以缓解症状。对该抗体进行部分纯化，可以在Ig G1和IgG 3的成分中发现抗体。另外一个自身免疫现象也出现在该组中，包括出现抗甲状腺抗体、呈斑点图案的抗核抗体等，但没有发现系统性红斑狼疮[1，13]。定义自身免疫性疾病的标准除上述情况外，还要求在实验动物身上能够复制疾病，尽管目前还没有用抗FcεRI自身抗体来进行动物试验，但检测出慢性荨麻疹外周血中的自身抗体，可以避免过多的过敏原检测费用，并为医师使用免疫调节剂治疗该类疾病提供依据。

抗FcεRI自身抗体主要有自身血清皮肤试验、嗜碱粒细胞组胺释放试验、免疫印迹方法和基于重组蛋白sFcεRIα的ELISA试验等检测方法。本课题组应用这几种检测方法并对其进行了系统比较研究，认为免疫印迹方法稳定性好，实验结果可靠;嗜碱粒细胞组胺释放试验可以检测出功能性的抗FcεRI自身抗体，但操作步骤繁琐;ASS T方法虽较简单，但无菌要求严格，测试前需要患者停用抗组胺药物[11，14-15]。通过比较发现，3种方法可相互借鉴和弥补，供临床诊断自身免疫性荨麻疹时使用。

嗜碱粒细胞组胺释放试验要求纯化嗜碱粒细胞，BAT使用全血标本，通过流式细胞仪测定表面分子的变化判断靶细胞的活化，因此试验周期短。由于嗜碱粒细胞活化后，针对CD63分子变化检测的信号敏感性强，大多数文献采用CD63分子判断嗜碱粒细胞的活化，在本研究中使用了特异性强的CD203c分子，通过3次设门，排除淋巴细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞等，检测荨麻疹血清对嗜碱粒细胞的活化信号。本实验结果证明，使用的3种抗体标记白细胞，3次设门可以有效判断嗜碱粒细胞的活化情况。本实验中有2例ASS T阳性血清呈现阴性反应，可能为凝血因子导致的ASST阳性反应，而非抗FcεRI抗体所致。由于荧光标记抗体的价格因素可能会限制该方法的临床推广应用。

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