齐贵胜，李玉红

(1.聊城职业技术学院病理学教研室，山东 252000;2.山东省聊城市人民医院病理科 252000)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率有逐渐上升的趋势，其发生、发展和浸润扩散机制尚不清楚。肿瘤细胞增殖/凋亡失衡及新生血管形成与大多数肿瘤的发生、发展有重要关系，研究发现 Twist能通过多种途径抑制细胞凋亡，在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥重要作用[1];VEGF在人类多种恶性肿瘤中过度表达，并与肿瘤的侵袭性生长有关[2]。本研究采用免疫组化技术检测乳腺癌组织中Twist和VEGF的表达，并分析Twist和VEGF表达的相关性及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择本院病理科存档的2008年6月至2009年5月外检乳腺浸润性导管癌组织标本蜡块63份(术前均未经放疗、化疗及激素治疗)，均为女性患者，年龄32～71岁，平均49.78岁。根据Elson-Ellis半定量分级法进行组织学分级:Ⅰ级22例，Ⅱ级 29例，Ⅲ级 12例;选择20例乳腺纤维腺瘤为对照组。病理诊断经两位病理学专家复核证实。

1.2 试剂 Twist鼠抗人单克隆抗体为Santa Cruz公司产品(工作浓度为1∶200);鼠抗人VEGF单克隆抗体(即用型)及免疫组化试剂盒购自福州迈新公司，操作步骤按说明书进行。

1.3 方法 所有标本经10%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋。将每例蜡块作4μm厚连续切片，采用免疫组化Elivision Plus法检测组织中Twist和VEGF的表达。用已知的阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断 Twist、VEGF表达以胞质呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。参照文献[3]半定量判断Twist、VEGF免疫组化结果，光镜下随机观察免疫组化切片5个高倍镜视野，每个视野计数200个细胞，共计1000个细胞;按着色程度评分:0分为无着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;按阳性细胞所占比例评分:0分为阴性，1分为小于10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为大于 75%。以两者乘积判定结果:4～12分为阳性，4分以下为阴性。

1.5 统计学处理 应用SPSS11.5软件进行统计学处理，组间比较采用χ2检验，Twist和VEGF表达的相关分析采用非参数相关性 Spearman检验，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Twist、VEGF在乳腺癌和乳腺纤维腺瘤组织中的表达比较 Twist、VEGF在乳腺癌组织中表达阳性率分别为57.14%、63.49%，明显高于其在乳腺纤维腺瘤中的表达阳性率(15.00%、35.00%)，差异有统计学意义(P=0.001，P=0.025)，见表1。

2.2 Twist、VEGF表达水平与乳腺癌临床病理特征的关系Twist表达阳性率与乳腺癌腋窝淋巴结转移、组织学分级呈显著正相关(P=0.03，P=0.023);VEGF表达阳性率与乳腺癌腋窝淋巴结转移、组织学分级呈显著正相关(P=0.038，P＜0.006)。Twist和VEGF阳性表达率均与患者年龄、肿瘤大小无关(P＞0.05)，见表2。

表1 乳腺癌及乳腺纤维腺瘤组织中Twist和V EGF的阳性表达

表2 Twist、VEGF表达与乳腺癌临床病理特征的关系

2.3 乳腺癌组织中 Twist、VEGF表达的相关性 63例乳腺癌组织中 Twist和 VEGF同时表达阳性30例(47.62%);Twist和VEGF同时表达阴性17例(26.98%)。经非参数相关性Spearman检验，r=0.476，P＜0.01，说明 Twist表达与VEGF表达呈显著正相关。见表3。

表3 乳腺癌组织中 Twist、VEGF表达的相关性

3 讨 论

Twist作为果蝇、鼠、人等生物体内的一种碱性螺旋-环-螺旋转录因子，在胚胎生长发育阶段诱导细胞迁移的调控过程中起着关键作用[4]。研究发现Twist具有癌基因的特征，能编码凋亡抑制蛋白，通过多种途径引起恶性肿瘤的发生、发展，如通过抑制分化、阻断p53通路及 N-Myc的促凋亡作用、抑制 NFKB/TNF通路等，显示抗凋亡作用[5];Twist还可通过对Akt途径的正性调控作用抑制细胞凋亡[6]。上皮间质化(EM T)是胚胎发育阶段一种重要形态学特征，也是慢性炎症、纤维化及肿瘤进展中的一个重要过程[7]。Twist与其他一些基因如snail、slug等能够诱导 EMT，造成 E-Cadherin表达下调，导致其介导的细胞-细胞间黏附功能减弱或丧失，促进肿瘤细胞从原发灶脱落，侵入周围组织[8]。Rosivatz等[9]研究证实，Twist表达显著上调见于弥散性胃癌等恶性程度高、侵袭性强的肿瘤组织中。李坤等[10]采用免疫组化S P法研究112例食管鳞癌组织中Twist蛋白的表达，显示Twist表达增强与食管鳞癌的发生和远处转移有关，对患者术后生存时间有显著影响。

血管生成在实体肿瘤的恶变、生长和转移等方面起着重要作用。VEGF被认为是最重要的血管生成因子之一，它能够促进血管内皮细胞增殖，增强血管壁通透性，还可以诱导内皮细胞降解细胞外基质，介导其迁移和浸润[11]。大量研究证实VEGF过表达可促进恶性肿瘤的生长、浸润和转移[12]。Yang等[13]研究显示Twist对癌细胞的血管内渗和肺转移起重要作用，应用RNA干扰技术抑制Twist的表达后能明显降低肿瘤肺转移效率和肿瘤细胞进入血液循环的数目。

本实验结果显示乳腺癌组织中Twist和VEGF的表达阳性率分别为57.14%、63.49%，明显高于对照组(P=0.001，P=0.025)，Twist和VEGF的表达阳性率与患者有无腋窝淋巴结转移及组织学分级显著相关(P＜0.05)，提示Twist和VEGF共同参与了乳腺癌的发生、发展，并与乳腺癌的恶性程度密切相关，肿瘤级别越高，Twist、VEGF表达越强，越容易发生浸润、转移。本实验结果表明，乳腺癌组织中 Twist表达，与VEGF表达呈显著正相关(P＜0.01)，二者关联可能源于Twist表达上调增强了VEGF的表达。有研究表明在乳腺癌细胞株中Twist过表达可增强VEGF表达、诱导血管生成，并且与染色体不稳定性密切相关[14]。由此可见Twist和VEGF在乳腺癌发生、发展中发挥着重要作用，Twist可能通过上调VEGF的表达，促进肿瘤组织血管生成，增强肿瘤细胞的侵袭力，从而成为其促进乳腺癌浸润、转移的可能途径之一，联合检测Twist和VEGF的表达状况，对于正确评估乳腺癌的恶性程度、发展和预后具有一定意义，对乳腺癌的诊断和治疗具有重要的临床参考价值。

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