郭志英，任启伟△，易 成，王树人，巴再华，刘晓岚

(1.济宁医学院基础学院病理与病理生理学教研室，山东 272013;2.四川大学华西医院腹部肿瘤科，成都 610041;3.四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学教研室，成都 610041)

胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(cytosine deaminase/5-fluorocytosine，CD/5-FC)系统是肿瘤基因治疗的研究热点。以往多采用腺病毒或逆转录病毒作载体，由于基因转染效率低、安全性差，故不能广泛应用于临床。本文用婴儿双歧杆菌作基因转运载体，根据实体瘤内低氧代谢特点及厌氧菌趋低氧环境的特性，婴儿双歧杆菌可靶向定植于实体肿瘤局部，并在局部表达其携带的外源基因CD，后者能将抗癌前药5-FC转变为毒性代谢产物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，进而杀死肿瘤细胞。本研究在构建婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC系统基础上，进一步检测并探讨其对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的体外杀伤效应。

1 材料与方法

1.1 材料 B16-F10鼠黑色素瘤细胞株(武汉大学中国典型培养物保藏中心)，婴儿双歧杆菌2001(卫生部华西口腔生物医学工程重点实验室微型厌氧培养系统研究基地提供)，逆转录PC R试剂盒(Invitrogen公司)，5-FC(Sigma公司，用 0.9%生理盐水溶解)，重组质粒p GEX-CD、200 bp DNA Marker(本实验室保存)。

1.2 重组质粒pGEX-CD转染婴儿双歧杆菌及鉴定

1.2.1 重组质粒pGEX-CD的构建 前期已完成[1]。

1.2.2 转染 婴儿双歧杆菌于37℃厌氧培养，用电穿孔法将重组质粒p GEX-CD瞬时转染至婴儿双歧杆菌，然后将菌液涂布于M RS固体培养基(含5%氨苄青霉素)，继续厌氧培养，72 h后，挑选阳性克隆菌进行鉴定。

1.2.3 鉴定 挑选阳性克隆菌，提取细菌的总DNA及总RNA，分别进行CD基因的 PCR扩增和RT-PCR扩增(具体操作按试剂盒说明书进行)，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。CD基因引物序列为:上游引物:5′-ATG GAT CCG GAG GCT AAC AAT G-3′，下 游引 物:5′-GGG GAA TTC TGT AAC CCA GTC GT-3′。

1.3 阳性转化菌联合5-FC对鼠黑色素瘤B16-F10细胞株的杀伤效应检测

1.3.1 细菌培养及菌液处理 在阳性转化菌中加入5-FC(终浓度为1 mmol/L)，37℃厌氧培养，24 h后离心收集菌液上清液。然后加入醋酸乙酯，离心吸取上清液，真空干燥后用生理盐水溶解，由此获得细菌处理液。

1.3.2 M TT法测定细胞存活率 以2×104/孔将B16-F 10细胞接种于96孔培养板，然后每孔内加入细菌处理液。实验分为3组:空白对照组、pGEX组(pGEX空质粒转化菌处理组)及CD组(pGEX-CD重组质粒转化菌处理组)，每组均设3个复孔。48 h后观察各组细胞形态学改变，并采用M TT法检测细胞存活率，用酶标仪于490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值。计算方法为:细胞存活率(%)=实验组A值/对照组A组×100%。

1.4 统计学处理 应用S PSS13.0统计软件进行数据分析。所有计量资料均以表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CD基因检测结果 PC R及RT-PCR扩增产物进行凝胶电泳，结果在相应泳道上分别出现一大小约1.3 kb的特异性片段，与CD基因片段大小一致。证实外源性CD基因片段已整合至婴儿双歧杆菌细菌基因组中，并能在m RNA水平上表达(图1)。

2.2 B16-F 10肿瘤细胞形态学变化 B16-F10细胞加入细菌处理液继续培养48 h后，各组细胞形态学变化有明显不同(图2)。CD组的肿瘤细胞大部分死亡，仅有少数细胞贴壁生长，培养液中可见大量细胞碎屑，残存的细胞形态发生明显变化，原有的贴壁生长形态消失，胞核固缩，折光性下降，表现出明显的细胞损伤改变，而空白对照组和p GEX组的肿瘤细胞形态变化均不明显。

图1 PCR及RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图2 各组细胞形态学变化(×200倍)

2.3 各组细胞存活率 菌液中加入5-FC共培养，阳性转化菌所表达的CD即可将5-FC转变为 5-FU，然后杀伤B16-F10肿瘤细胞。细胞存活率结果显示，CD组的细胞存活率为(47.60±1.27)%，明显低于空白对照组[(98.25±0.53)%]和pGEX组[(93.57±2.38)%]，差异有统计学意义(P=0.000)。而空白对照组与pGEX组差异无统计学意义(P=0.098)。表明CD基因在婴儿双歧杆菌中成功表达，并能够将5-FC转化为5-FU，抑制肿瘤细胞生长。

3 讨 论

肿瘤自杀基因治疗是将“自杀”基因(suicide gene)导入肿瘤细胞，表达的基因产物能把无毒的抗癌前药(prodrug)转化成抗癌药物，进而杀伤肿瘤细胞[2]。近年来CD/5-FC系统是肿瘤自杀基因治疗的研究热点。人类及其他哺乳动物体内不含有CD基因，研究所用的CD基因主要来源于大肠埃希菌，其表达产物约为48000。5-FC是一种抗真菌药物，本身并不具有抗癌作用，但在CD的催化作用下可脱去氨基转化成5-FU。5-FU是临床上常用的抗代谢类抗肿瘤药物，在体内可被嘧啶代谢酶系转化为毒性代谢产物 5-氟脱氧单磷酸尿嘧啶(5-Fd UMP)、5-氟脱氧三磷酸尿嘧啶(5-Fd UTP)和5-氟三磷酸尿嘧啶(5-FU TP)，进而干扰或阻断细胞的核酸代谢，造成细胞死亡[3-4]。传统自杀基因治疗多采用腺病毒或逆转录病毒作载体，进而转化肿瘤细胞。研究表明此疗法存在以下缺点:(1)转化效率低，即使存在“旁观者效应”，抗瘤效果也很局限;(2)腺病毒和逆转录病毒作载体，安全性难以保证;(3)全身途径给药不可避免会引起正常组织细胞被转化，不良反应较大[5-8]。鉴于以上几点，迫切需要探索一种新的、更加安全可靠的载体系统用于肿瘤基因治疗。

人类大多数肿瘤属于实体瘤，且瘤体内部通常存有低氧代谢区[9]。根据这一特点，当全身静脉推注厌氧菌后，厌氧菌趋低氧环境的特性可使其靶向定植于实体肿瘤局部，并由孢子状态迅速活化，进而大量增殖。前期实验通过放射性同位素体内示踪、组织匀浆厌氧培养及组织切片等技术已证实婴儿双歧杆菌对小鼠黑色素瘤具有明显的靶向特性[10]。在此基础上，本研究构建出携带CD基因的重组婴儿双歧杆菌，静脉推注后细菌可迅速定植于实体瘤局部，表达外源基因酶活性，并将全身途径给予的抗癌前药5-FC转化为抗癌药5-FU，专性杀伤肿瘤细胞。与传统自杀基因治疗相比，这种改良后的自杀基因治疗体系有以下优越性:(1)对实体瘤靶向性强，全身途径给药后可减少对正常组织的损伤，降低不良反应;(2)携带自杀基因的转化菌在肿瘤局部活化后直接表达酶活性，不必再去转化癌细胞，转化效率明显提高;(3)婴儿双歧杆菌属于非致病性厌氧宿主菌，正常即存在于人类及其他哺乳动物的低位小肠和大肠中，以此为载体安全性较高。

本研究结果表明，CD组的细胞形态发生明显改变，细胞存活率明显降低，提示婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC肿瘤基因治疗体系初步构建成功，能够表达CD活性，杀伤肿瘤细胞，降低细胞存活率。随着肿瘤基因治疗体系的不断发展和完善，这种抗癌微生物介导的基因治疗很有可能成为下一步肿瘤治疗的研究焦点，进而向临床逐步推广应用。

[1]郭志英，易成，王树人，等.婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统的构建[J].中国肺癌杂志，2004，7(2):95.

[2]杨桦.直肠癌的外科治疗进展[J].重庆医学，2009，38(5):505.

[3]Cheng YI，Huang Y，Guo ZY，etal.Con-struction of Bifidobacterium Infantis/CD Targeting Gene Therapy System[J].The Chinese-German Journal of Clinical Oncology，Aug ，2005，4(4):244.

[4]Yazaw a K ，Fujimori M ，Amano J，et al.Bifidobacterium longum as a delivery system for cancer gene therapy:selective localization and grow th in hypoxic tumors[J].Cancer Gene Therapy，2006，12(2):269.

[5]王治伟，杨强，赵渝，等.肿瘤靶向治疗技术现状[J].重庆医学，2009，38(6):713.

[6]吴秀伟，利炜，何远春，等.多肿瘤标志物蛋白芯片系统在鉴别良恶性胸腹腔积液中的价值[J].安徽医药，2009，13(3):57.

[7]窦晓辉，赵晓明，王燕群，等.重组人p53腺病毒注射液联合化疗治疗喉癌的试验研究[J].海南医学，2007，18(07):127.

[8]李常林，张艳，何培华，等.肿瘤标志物联合检测对恶性肿瘤诊断的意义探讨[J].检验医学与临床，2009，6(15):30.

[9]Yazaw a K ，Fujimori M ，Nakamura T ，et al.Bifidobacterium longum as a delivery system for gene therapy of chemically induced ratmammary tumors[J].Breast Cancer Research and T reatment，2007，72(3):165.

[10]吴瑜，易成，王树人，等.婴儿双歧杆菌对小鼠黑色素瘤模型肿瘤组织的靶向性[J].四川大学学报:医学版，2005，36(3):436.