吕 群，张小建，杨业洲，李晓洁，闵丽华

(四川省医学科学院/四川省人民医院辅助生殖医学中心，成都 610072)

体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗过程中移植胚胎70%以上都不能发生着床，既有子宫环境因素也有胚胎自身原因。透明带(ZP)作为重要的生殖屏障，是包裹在卵母细胞外的一层蛋白质基质阻止异种精子、多精受精以及白细胞的渗入[1]，同时维持细胞的正常排列，避免分裂期卵裂球脱离胚胎，确保正常发育。然而，要完成着床，囊胚期内细胞团必须从ZP中孵出，从动物模型得知，孵化涉及ZP被胚胎自身或生殖道分泌的酶类溶解。ZP异常是阻碍IVF治疗中囊胚成功孵出的一个重要环节，可能是影响辅助生殖技术成功率的一个重要因素。在胚胎质量和囊胚形成率没有显著差异的前提下，冷冻胚胎移植(FET)的妊娠率及胚胎种植率仍然比新鲜胚胎移植低[2]。人工培养基环境本身能够促使ZP变硬，同时在行冷冻、解冻过程中这种ZP硬化现象进一步加剧，降低了冷冻移植周期的临床结局。本文分析了激光辅助孵化在FET周期中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2007年4月至2009年6月在本院生殖中心施行FET的患者，所有患者移植胚胎均为第3天行冷冻的分裂期胚胎，排除解冻后无移植胚胎的患者，共 85例患者88个周期纳入分析。根据患者知情同意后的选择将其分为80μm激光辅助孵化(57个周期)为AH组和未孵化组(31个周期)。

1.2 IVF-ET程序 患者采用常规长方案或短方案[3]，用促性腺激素激动剂(Gn RH-a，达必佳，德国)降调，重组促排卵素(rFSH，果纳芬，瑞士)或人绝经期促性腺激素(HMG，丽珠制药)促排卵，阴道超声监测卵泡发育，当双侧卵巢有 2个以上卵泡直径大于18 mm时，注射绒促性素250μg(HCG，艾泽，瑞士)，36 h后取卵。取卵后3～4 h行常规IVF或单精子卵胞浆注射(ICSI)。16～18 h后观察受精情况，2个原核为正常受精，72 h后行新鲜周期移植或冷冻。

1.3 FET方法 采用人工周期准备内膜，月经第3天予戊酸雌二醇(补佳乐 拜耳先灵)3 mg，每天 2次，当内膜达 8 mm以上，予黄体酮40 mg肌注，72 h后移植。

1.4 胚胎冷冻、解冻方案 第3天新鲜周期移植后，剩下的可利用胚胎行慢速程序冷冻，冷冻及解冻操作均在37℃条件下进行。冷冻程序:0.5 M丙二醇5 min、1.0 M 丙二醇5 min、1.5 M丙二醇10 min、1.5 M丙二醇和0.5 M蔗糖溶液装管。用Planer程度冷冻仪，每分钟降2℃从37℃降温至-6℃，常规植冰，保持10 min，每分钟降 0.3℃降温至-35℃，投入液氮容器保存。解冻程序:胚胎冷冻管在室温下30 s，30℃水浴30 s。将胚胎依次放入1.0 M丙二醇、0.2 M蔗糖液中10 min;0.5 M丙二醇、0.2 M 蔗糖 10 min;平衡液15 min。解冻后行激光辅助孵化，然后转入囊胚培养液培养直至移植。解冻后胚胎卵裂球存活数:≥50%为存活胚胎[4]。

1.5 激光辅助孵化程序 使用 RI(research instruments，英国)激光辅助孵化系统，用1.48μm二极体激光发射汽化 ZP，作用时间800μs，依次发射激光削薄ZP，使削薄区域约为 80 μm ZP周长，削薄程度大于ZP厚度的50%，孵化后用含5%人血清蛋白(HSA)的囊胚培养液(SAGE BiopharmaTM，USA)洗涤数次，移入囊胚培养液培养4 h后移植。

1.6 临床结局判定 移植后4周B超检查有孕囊确定为临床妊娠。

1.7 统计学处理 应用SPSS11.0软件行非配对样本均数t检验，各组均数以表示，对组间百分率行χ2检验;以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组常规数据比较，两组常规数据无差异(P＞0.05)，见表1。

表1 两组常规指标比较

2.2 两组冷冻胚胎相关指标比较 见表2。

表2 两组间冷冻胚胎相关指标比较

3 讨 论

本研究结果表明，在两组患者一般资料、IVF/ICSI的一般结果差异无统计学意义的情况下(表1)，胚胎解冻存活率、平均移植胚胎数两组比较差异无统计学意义(表2)，但是AH组在妊娠率及胚胎着床率方面都有显著优势，这一结论证实AH对处于分裂期冷冻的胚胎移植的患者能有效提高临床治疗结局。

1990年首次提出胚胎孵出失败可能是由于ZP厚度增加或是变硬引起的，AH后的胚胎往往孵出时间提前。由于提前孵出，能更早地与子宫内膜接触并建立活性因子间的交流，从而更易着床。尽管在IVF反复失败、高龄妇女等周期中AH已取得一定的优势[5-6]，但是否适于常规应用，仍然值得探讨，特别是AH能进一步引起多胎妊娠等并发症的产生。Edi-Osagie等[7]研究表明，AH 能提高临床妊娠率，特别是对反复IVF失败患者尤为明显，但是对活产率并没有显著提高。本研究结果显示，尽管AH组与未孵化组多胎数并无显著差异，但由于统计样本有限，仍需大样本分析。

冷冻移植周期中冷冻、解冻过程以及过长的体外培养时间使ZP糖蛋白基质变性，引起ZP变硬，因此理论上认为AH能够提高FET的结局。但是，在发表的文献中仍然存有争议，Check等[8]采用酸溶液对冷冻移植胚胎孵化以后，妊娠率及着床率都有显著提高，同样的结论在Gabrielsen等[9]和周平等[10]研究中得到证实。但是不同的结论也有报道，Edirisinghe等[11]的研究认为部分ZP切开对改善FET周期并没有意义。尽管有研究证实不同孵化方法的治疗结局并没有差异，但是孵化的操作细节及操作的熟练程度的差异、冷冻胚胎的入选标准及冷冻胚胎发育时期和胚胎解冻培养时间都有可能是造成临床结局不一致的原因[12]。

常规AH研究主要集中探讨各种孵化方法对治疗结局的影响，比如最早使用的机械切割技术，以及随后的酸性液、酶等化学消化技术和目前较为普遍的激光孵化技术等，都对治疗结局起到了一定的作用。但是针对胚胎ZP的处理参数方面的研究较少。如AH过程中就采用打孔或者削薄，以及打孔的大小和削薄的尺寸目前都没有较明确的定论。本研究结果表明对ZP进行约80μm周长、50%厚度处理，与未孵化组比较能够取得较好效果，与孙玲等[13]报道结果趋于一致。对ZP处理程度的报道较少，同时存在不同的结论，Hiraoka等[14]对解冻后培养至囊胚期的胚胎进行50%及40μm的ZP打孔处理，移植后50%ZP AH组临床结局显著优于40μm AH组及未孵化组。对ZP操作的尺寸，目前研究较少，可能原因是孵化方法上存在差异，以及在试验前对胚胎的处理不同导致孵化作用对ZP的损伤也存在不同，导致后期胚胎的发育潜能不同。同时由于本研究纳入患者周期数较少，在单、双胎方面没有差异，这与报道存在出入[15]。

综上所述，对ZP处理的范围大，临床效果相对较佳，但这并不意味着将ZP剔除就更有利于胚胎的孵出。相关结论还有待进一步研究。

[1]Wassarman PM.M ouse gamete adhesion molecules[J].Biol Reprod ，1992，46(2):186.

[2]Mantoudis E ，Podsiadly BT ，Gorgy G，et al.A comparison between quarter，partial and total laser assisted hatching in selected infertility patients[J].Hum Reprod，2001，16(10):2182.

[3]张中书，商学军.促性腺激素释放激素及其类似物在生殖系统的应用[J].重庆医学，2009，38(5):604.

[4]Freeman L，Trounson A，Kirby C.Cryopreservation of human embryos:process on the clinical use of the technique in human in vitro fertilization[J].J Assist Reprod Genet，1986，3(1):53.

[5]罗亚宁，肖西峰，王晓红，等.激光辅助孵化在前次IVFET失败患者中的应用[J].武警医学院学报，2008，17(5):420.

[6]黄志辉，朱元，许定飞，等.胚胎行激光透明带辅助孵化13例临床妊娠报道[J].江西医学，2010，45(5):460.

[7]Edi-Osagie E，Hooper L，Seif MW.The impactof assisted hatching on live birth rates and outcomes of assisted conception:a systematic review[J].Hum Reprod，2003，18(9):1828.

[8]Check JH，Hoover L，Nazari A ，et al.The effect of assisted hatching on pregnancy rates after frozen embryo transfer[J].Fertil S teril，1996 ，65:254.

[9]Gabrielsen A，Agerholm I，Toft B ，et al.Assisted hatching improves implantation rates on cryopreserved-thaw ed embryos.A randomized prospective study[J].Hum Reprod，2004，19(10):2258.

[10]周平，曹云霞，章志国，等.激光辅助孵化联合囊胚培养提高冻胚移植的妊娠率[J].中国妇幼保健，2010，25(1):74.

[11]Edirisinghe WR，Ahnonkitpanit V，Promviengchai S，et al.A study failing to determine significant benefits from assisted hatching:patients selected for advanced age，zonal thickness of embryos，and previous failed attempts[J].J Assist Reprod Genet，1999，16(6):294.

[12]邢琼，周平，章志国，等.辅助孵化与培养时间对冻融胚胎移植结局的影响[J].生殖医学杂志，2007，16(1):16.

[13]孙玲，陈士岭，李劲，等.两种不同激光辅助孵化方法对体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响[J].广东医学，2007，28(5):733.

[14]Hiraoka K ，Fuchiw aki M ，Hiraoka K ，et al.Effect of the size of zona pellucida opening by laser assisted hatching on clinical outcome of frozen cleaved embryos that were cultured to blastocyst after thawing in w omen with multiple im plantation failures of embryo transfer:a retrospective study[J].J Assist Reprod Genet，2008，25(4):129.

[15]张晓慧，曹云霞，魏兆莲，等.辅助生育技术中单卵双胎及其妊娠相关因素分析[J].生殖医学杂志，2008，17(2):135.