卢秋维，李东明

(广西壮族自治区:1.人民医院检验科;2.妇幼保健院优生遗传科，南宁 5300211)

β-珠蛋白生成障碍性贫血是广西地区危害最大的血红蛋白病，目前尚缺少有效的治疗方法，尤其是重型β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿要靠输血维持生命，给家庭和社会带来沉重的负担[1-3]。因此，对夫妇双方为β-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带的孕妇进行产前诊断，是防止此类患儿出生的有效措施。但因母体血污染导致重型珠蛋白生成障碍性贫血胎儿的误诊或漏诊时有发生[4-5]，为此本研究对羊水细胞进行原位培养，采用培养后细胞进行β-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测，避免了反复取材，提高了诊断的准确性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 夫妇均为β-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带的妊娠426例，其中曾生育重型β-珠蛋白生成障碍性贫血患儿者105例，有重型β-珠蛋白生成障碍性贫血胎儿引产史者17例，接受遗传、产前咨询者 304例。夫妇双方合并α-珠蛋白生成障碍性贫血杂合子37例。

1.2 标本采集及细胞培养 在孕13～28周，B超引导下行羊膜腔穿刺抽取羊水10～15 m L，置两支15 m L无菌离心管中，血性羊水加入EDTA-K2抗凝。将1管羊水离心，弃上清液，留下1 m L左右;混匀后吸入装有 3 m L AM-Ⅱ(美国GIBCO公司)培养基的原位培养瓶中，置37℃、5%二氧化碳培养箱培养5～7 d后，置倒置显微镜下观察，当出现 3～5个细胞克隆后，换掉培养液，当出现大量贴壁细胞时，用生理盐水反复清洗后，转移到1.5 m L EP管内备用。

1.3 珠蛋白生成障碍性贫血基因检测 对培养后细胞采用快速DNA提取试剂盒(深圳益生堂公司)进行DNA提取，采用单管多重PC R体系进行珠蛋白生成障碍性贫血基因扩增，结合反向点杂交技术检测17种β和3种α-珠蛋白基因突变类型，限制性酶切结合琼脂糖凝胶电泳技术检测3种α-珠蛋白基因缺失类型，按试剂盒说明书进行操作及结果判断。

2 结 果

426例羊水标本，其中血性羊水2例，离心后肉眼可见血细胞6例，镜下可见血细胞 13例，均培养成功，共检出β-珠蛋白生成障碍性贫血302例，见表1。同时检出 Hb Bart′s水肿胎9例，其中复合β-珠蛋白生成障碍性贫血双重杂合子4例;Hb H病1例;α-珠蛋白生成障碍性贫血杂合子17例，其中复合β-珠蛋白生成障碍性贫血纯合子1例，双重杂合子3例。21例母体血污染标本，检出β-珠蛋白生成障碍性贫血16例，其中β-珠蛋白生成障碍性贫血纯合子1例;双重杂合子5例，包括复合Hb Bart′s水肿胎1例;杂合子10例，包括复合α-珠蛋白生成障碍性贫血杂合子2例。另检出α-珠蛋白生成障碍性贫血杂合子1例。终止妊娠107例，在本院引产或分娩的胎儿均经验证，结果相符，随访238例，无畸形。

表1 培养后细胞β-珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断结果

3 讨 论

β-珠蛋白生成障碍性贫血是β-珠蛋白基因缺失或突变导致血红蛋白的珠蛋白肽链缺失或合成减少引起的溶血性遗传病。若夫妇双方为同型珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者，每次妊娠胎儿有25%为重型珠蛋白生成障碍性贫血儿。因此，对高风险人群进行产前基因诊断有着重大意义[2，6]。目前，进行胎儿基因诊断的取材方法主要有3种:经腹腔或宫颈绒毛活检术、羊膜腔穿刺术和经腹脐带穿刺术。前者技术难度较大，1次取材成功率不高，且可增加胎儿畸形的发生率，易受蜕膜细胞污染造成误诊[7-8]。羊膜腔穿刺术具有操作简便、并发症少等优点，是临床应用最广泛的取材方法[9]。脐带穿刺术操作难度较大，诊断时间也较晚，不易发现少量母血污染[10]。本组426例孕妇行羊膜腔穿刺术取羊水，进行珠蛋白生成障碍性贫血产前基因诊断，穿刺成功率为100%，无严重并发症发生。

羊膜腔穿刺过程中难以避免母体血的污染，而不能检测或再次取样[11];当标本仅有极少量母体血污染，尤其是肉眼或离心后仍不可见时，易导致误诊[12]。基于胎儿羊水细胞贴壁生长，而血细胞不贴壁生长的特点，本研究应用细胞原位培养法对羊水细胞进行培养，采用培养后细胞进行珠蛋白生成障碍性贫血产前基因诊断。426例标本均培养成功，共检出β-珠蛋白生成障碍性贫血302例(70.89%)，其中纯合子31例，双重杂合子70例，与国内外报道相近[7，13]，也与东南亚地区为珠蛋白生成障碍性贫血高发区相一致。同时检出α-珠蛋白生成障碍性贫血27例，其中重型α-珠蛋白生成障碍性贫血10例，包括复合重型β-珠蛋白生成障碍性贫血8例，与陈萍等[5]报道类似。值得注意的是夫妇双方为α复合β-珠蛋白生成障碍性贫血的孕妇中，因重型珠蛋白生成障碍性贫血引产或生育史而行产前诊断者有17例，此次诊断为重型珠蛋白生成障碍性贫血者有5例，其中1例已有3次重型珠蛋白生成障碍性贫血孕、育史。为避免该类患儿的出生而再次终止妊娠，建议这类夫妇进行植入前产前诊断[14-15]，这对降低出生缺陷有重要意义。

值得注意的是，本研究 426例标本中，离心前、后肉眼可见母体血细胞污染标本8例，细胞培养时发现13例，在显微镜下仍可见一定数量的血细胞;当羊水细胞贴壁后，保留换出的培养液。对检测结果为β-珠蛋白生成障碍性贫血纯合子和杂合子且与孕妇基因型不同的5例，再用换出的培养液提取DNA进行检测，仅有1例仍为β-珠蛋白生成障碍性贫血杂合子。考虑可能该标本中的血细胞较少，以及提取过程中的丢失，导致该标本中的母亲基因型未被扩增出来。表明当有母体血污染时，尤其是肉眼不可见或离心后仍不可见的少量母体血污染的标本，一旦被扩增出来，可导致杂合子误诊为β-珠蛋白生成障碍性贫血双重杂合子或漏诊β-珠蛋白生成障碍性贫血纯合子[9]。同样，若夫妇双方为东南亚缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血携带者，当有母体血污染时，Hb Bart′s水肿胎可误诊为东南亚缺失型[12]。因细胞培养技术难度较大，故对不具备细胞培养条件的基层医院，应对羊水细胞离心后在显微镜下进行分析，减少母体血污染导致的误诊。

综上所述，为了减少珠蛋白生成障碍性贫血患儿的出生，应加强孕龄人群珠蛋白生成障碍性贫血产前筛查和基因确诊[16-17]。对夫妇为同型基因携带者，在孕中期行羊膜腔穿刺术获取羊水细胞，对羊水细胞进行原位培养，所需标本量较少，培养成功率高。采用培养后细胞进行珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断，可避免母体血污染导致的误诊，提高产前诊断的准确性;同时避免多次取材，减少流产的发生。

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