蒋文 边莉 李瑰琦 马丽菊 唐睿珠 何永文

（1.昆明医学院附属口腔医院 口腔研究所，云南 昆明 650031；2.荆州市第一人民医院 口腔科，湖北 荆州 434000；3.昆明医学院第一附属医院 病理科，云南 昆明 650032）

高温治疗癌症已在临床上得到较广泛应用，并取得较满意效果。近年研究发现，临床常规热疗（41～45℃）主要通过诱导肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤，但分子学机制尚未完全清楚。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是哺乳动物细胞浆内的脂质依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，参与调节细胞增殖、分化和死亡，可作为肿瘤治疗靶点[1-2]。其家族成员PKC-δ在不同类型的细胞中、不同刺激作用下可发挥促凋亡或抗凋亡的功能[3-4]。但其在热疗诱导肿瘤细胞凋亡过程中的作用尚待探索。因此，本研究以人舌鳞癌Tca8113细胞株为实验对象，应用PKC-δ的活化抑制剂Rottlerin研究热诱导Tca8113细胞凋亡时PKC-δ的作用，以期为临床肿瘤热疗提供新的治疗思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料及仪器

人舌鳞癌Tca8113细胞株购自中国科学院上海细胞库，RPMI 1640培养基（Thermo公司，美国），PKC-δ抑制剂Rottlerin（Alexis公司，瑞士），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Amresco公司，美国），PKC-δ抗体（BD公司，美国），羊抗鼠（Ⅱ抗）（KPL公司，美国），碘化丙啶（propidium iodide，PI）、Rhodamine 123及Caspase-3活性检测试剂盒购自碧云天生物研究所。电热恒温水浴箱（江苏环保仪器厂），Coulter Epics XL流式细胞仪（Beckman公司，美国）。DM LS2显微镜（Leica公司，德国），DYY-7C型电泳仪（北京市六一仪器厂），酶标仪（One Lambda公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Tca8113细胞于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中（加青霉素1×105U·L-1、链霉素1×102mg·L-1）37 ℃，5%CO2条件下培养。

1.2.2 细胞热处理 取对数生长期且密度为培养瓶面积的80%～90%细胞用于实验，分成2组，分别加入Rottlerin（DMSO配制，终浓度10 μmol·L-1）和等体积的DMSO预处理细胞30min。43℃水浴槽中加热细胞0、40、80、120min。

1.2.3 凋亡率分析 细胞热处理后常规培养24 h，收获细胞，1 000 r·min-1离心5min，4℃冷PBS洗涤2次，70%预冷乙醇重悬细胞4℃固定过夜，PBS洗涤后100μg·mL-1PI 4℃避光染色30min，流式细胞仪检测DNA含量，以G0/G1前期亚二倍体峰为凋亡峰，计算细胞凋亡率。

1.2.4 Western杂交分析 细胞热处理后常规培养4 h，收获细胞，冰上裂解细胞15min，4℃ 12 000 r·min-1离心15min，提取全细胞溶解液，SDS-PAGE电泳，电转印至PVDF膜上，加一抗PKC-δ，4℃孵育过夜，TBST洗涤，5 min×3次，加二抗室温下孵育1 h，TBST洗涤，5min×3次，化学发光显影。

1.2.5 线粒体膜电位分析 细胞热处理后常规培养24 h，参考文献[5]的方法，终质量浓度为10μg·mL-1Rhodamine 123与细胞共培养30 min，收获细胞，PBS洗涤，流式细胞仪检测荧光强度。

1.2.6 Caspase-3活性的检测 细胞热处理后常规培养16 h，收获细胞，冰上裂解15min，提取全细胞溶解液，调整为相同蛋白浓度。取蛋白样品40μL加入50μL检测缓冲液中，再加入10μL无色的反应底物Ac-DEVD-pNA，37℃孵育过夜。待测样品液各100μL转移至96孔板中，酶标仪检测空白对照液和8个待测样品在波长为405 nm处的吸光度A值，以A405nm表示Caspase-3的相对活性。

1.2.7 统计学分析 应用SPSS 11.0软件进行统计学分析，组间差异比较采用方差分析，两组间差异比较采用LSD分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞的凋亡率

热处理后24 h，随加热时间延长，经Rottlerin与未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞凋亡率都逐渐增加（图1）。

各加热时间点2种方法预处理的细胞凋亡率经统计学分析显示，未加热时经Rottlerin与未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞凋亡率无差异（P＞0.05）；加热40、80、120min，2种方法预处理的细胞凋亡率有显著性差异（P＜0.01，表1）。

表1 各组Tca8113细胞的凋亡率（n=3，%，±s）Tab 1 Apoptosis rate of Tca8113 cells induced by heating（n=3，%，±s）

表1 各组Tca8113细胞的凋亡率（n=3，%，±s）Tab 1 Apoptosis rate of Tca8113 cells induced by heating（n=3，%，±s）

细胞凋亡率0min 40min 80min 120min Tca8113-Rottlerin组 4.76±0.88 12.3±1.91 31.5±2.61 36.53±0.65 Tca8113-DMSO组 4.90±0.72 22.1±1.35 43.2±1.57 49.90±1.25 P值 P＞0.05 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01项目

2.2 Western杂交分析结果

未加热时经Rottlerin与未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞，全长PKC-δ（7.8×104）表达明显，4×104的催化片段（protein kinase C-δ catalytic fragment，PKC-δCF）无明显表达；加热40min后，经Rottlerin与未经Rottlerin预处理Tca8113细胞全长PKC-δ和PKC-δCF都表达，但未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞中PKC-δCF表达水平高于Rottlerin预处理的细胞（图2）。以上结果说明加热可裂解活化PKC-δ，Rottlerin能抑制热诱导PKC-δ裂解活化。

2.3 细胞线粒体膜电位强度变化结果

随热处理时间延长，经Rottlerin与未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞弱荧光部分细胞含量都逐渐增高，但未经Rottlerin预处理细胞较Rottlerin预处理细胞更明显。加热40、80、120min，经Rottlerin与未经Rottlerin预处理细胞的弱荧光细胞百分比经统计学分析有显著性差异（P＜0.01，图3，表2）。

表2 各组Tca8113细胞弱荧光细胞百分比（n=3，%，±s）Tab 2 Percentage of hypofluorescence of Tca8113 cells induced by heat（n=3，%，±s）

表2 各组Tca8113细胞弱荧光细胞百分比（n=3，%，±s）Tab 2 Percentage of hypofluorescence of Tca8113 cells induced by heat（n=3，%，±s）

2.4 Caspase-3活性检测结果

经Rottlerin与未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞A405nm值随加热时间的延长而逐渐增加，表明Caspase-3的活性随加热时间的延长而逐渐增加。经统计学分析，未经加热处理，经Rottlerin与未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞A405nm值差异无统计学意义（P＞0.05），40、80、120min相同加热时间，Rottlerin预处理细胞的A405nm值低于未经Rottlerin预处理细胞的A值（P＜0.01，表3）。

表3 各组Tca8113细胞Caspase-3相对活性（n=3，±s）Tab 3 Relative activity of Caspaes-3 in Tca8113 cells（n=3，±s）

表3 各组Tca8113细胞Caspase-3相对活性（n=3，±s）Tab 3 Relative activity of Caspaes-3 in Tca8113 cells（n=3，±s）

3 讨论

PKC-δ是新型PKC亚型的成员，广泛存在于各种组织如脑组织和上皮组织细胞中，具有促凋亡作用。凋亡刺激激活的PKC-δ从胞浆转移至亚细胞器，磷酸化相应的底物，激活Caspase级联，最终诱发细胞凋亡，而Rottlerin可抑制这一过程[4]。PKC-δ对细胞的生存有负面作用，PKC-δ可增强放疗的凋亡诱导作用，提高放疗的敏感性[6-7]；阻断PKC-δ的凋亡信号传导，可导致肿瘤细胞增加对抗肿瘤药物的抗拒性[8]。PKC-δ是凋亡因子诱导多种类型肿瘤细胞凋亡信号传导途径中的重要激酶。喜树碱类似物NSC606985处理U937、NB4细胞，硼替佐米和三氧化二砷处理K562，都出现PKC-δ活化并诱导细胞凋亡[9-10]；FTY720可激活PKC-δ诱导肝癌细胞凋亡，抑制PKC-δ活化导致肝癌细胞对FTY720的抗拒性增加[11]；P53、P73和Fas受体缺乏的Hep3B细胞中，PKC-δ和c-Abl是阿霉素、顺铂、5-氟尿密啶诱导凋亡所需要的蛋白激酶[12]；而Rottlerin或负显性突变的PKC-δ可抑制这些凋亡因子诱导的PKC-δ活化及其诱导的凋亡发生。

PKC-δ全酶长7.8×104，裂解活化后主要形成PKC-δ CF（4.0×104）和PKC-δ RF。PKC-δCF是结构性的活化酶，对许多细胞类型有毒性作用；是强效力的细胞凋亡诱导因子，能触发线粒体释放细胞色素C，激活Caspase，诱导核内DNA片段化和细胞凋亡。研究[13]证实，热诱导U937细胞凋亡中，PKC-δ裂解活化，PKC-δCF的表达水平提高。本实验结果显示，加热后PKC-δCF在Tca8113细胞中表达水平提高。但相同热处理条件下，Rottlerin可抑制热诱导的PKC-δ的裂解活化和降低细胞凋亡率。表明热活化的PKC-δ可促进热诱导Tca8113细胞凋亡。

线粒体是PKC-δ的作用靶位，激活的PKC-δ转位线粒体，导致跨膜电位崩解和细胞色素C释放，细胞凋亡发生，而Rottlerin可抑制PKC-δ活化，抑制PKC-δ诱发的跨膜电位崩解和细胞凋亡[7]。Rhodamine 123是一种活细胞线粒体的阳离子荧光染料，正常细胞Rhodamine123荧光强度高，凋亡细胞荧光强度减低，坏死细胞不能吸收Rhodamine 123，不发荧光。本实验观察到，Rottlerin预处理Tca8113细胞，43℃热处理40、80、120min后24 h，其弱荧光细胞百分含量低于未经Rottlerin处理的Tca8113细胞；而未加热时两者弱荧光细胞百分含量基本一致。本实验结果显示，Rottlerin可部分地抑制热疗诱导Tca8113细胞跨膜电位崩解，说明抑制PKC-δ裂解活化可抑制其诱发的跨膜电位崩解。

PKC-δ活化出现在凋亡信号途径的早期，是线粒体凋亡途径的上游事件。Caspase家族是凋亡途径的主要执行者，其中Caspase-3为关键的执行分子，是线粒体凋亡途径的下游事件。PKC-δ激活是Caspase-3活化所必需的，Rottlerin或PKC-δ突变可抑制PKC-δ的激活，从而抑制其诱发的Caspase-3的活化，PKC-δ是Caspase-3的上游因子并调节其活性[14]。本实验结果显示，经Rottlerin与未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞Caspase-3相对活性值比较，未加热组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）；相同热处理条件下，经Rottlerin预处理的Tca8113细胞Caspase-3相对活性值低于未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞，统计学上有显著性差异（P＜0.01）。表明Rottlerin可降低热诱导Tca8113细胞中Caspase-3的活性。

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