王晓闻，章华平，陈 峰，王 茜，温伟业

(1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2.克莱姆森大学食品与营养系，美国 南卡罗来纳州 克莱姆森29634；3.克莱姆森大学遗传与生物化学系，美国 南卡罗来纳州 克莱姆森 29634；4.山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801)

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.) Makino)又名七叶胆、公罗锅底、落地生根、小苦药、遍地生根、五叶参等，属于葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属(Gynostemma)，多年生草质攀援藤本植物[1-2]，是一种传统的中药，在我国有悠久的应用历史。现代药理学研究认为绞股蓝具有降低胆固醇水平、调节血压、增强免疫能力、镇静、抗疲劳、抗溃疡等作用[3-5]。还有报道绞股蓝的水煎溶液有抑菌作用[6]。在报道的绞股蓝化学成分中主要是绞股蓝皂甙，据Scifinder 数据库资料显示，截至2007年7月科学家已经从绞股蓝中分离出100多种绞股蓝皂甙，但是未见有木脂素的报道。本研究在前期实验基础上，对分离得到的3种木脂素抑菌作用进行研究，为扩展绞股蓝的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

绞股蓝由山西农业大学动物药厂提供，由山西农业大学动物科技学院中兽医教研室鉴定为绞股蓝干燥全草，取根茎备用。

供试菌种：金黄色葡萄球菌(S ta ph y lo c co cu s aureus，C56024)、沙门氏菌(Salmonella enteritidis，ATCC 10708)、大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC 4350)、变异链球菌(Streptococcus mutansClarke，ATCC 25175TM)购于美国ATCC公司。

柱层析硅胶(200～300目) 青岛海洋化工有限公司；Sephadex LH-20凝胶、正反相薄层层析板德国Merk公司；AQ12S50-1000、ODS-AQ反相柱层析硅胶 日本YMC公司。

DPPH、BHT 美国 Sigma 公司；FeCl2、3-(2-吡啶基)-5,6-双(4-苯磺酸)-1,2,4-三嗪(Ferrozine) 美国Fluka公司；EDTA、甲醇 美国Fisher公司。

Brucker AM-300核磁共振仪(1H (300 MHz)、13C(75 MHz)、四甲基硅(TMS)为标准物质、CD3OD为样品溶剂)；Q-TOF microTM质谱仪 美国Waters 公司。

1.2 方法

1.2.1 绞股蓝木脂素的提取分离纯化

干燥的绞股蓝根及茎5kg用95%乙醇于室温下萃取3次(15L×3)，每次24h，合并萃取液，减压浓缩干燥，得乙醇粗提物。将粗提物分散于适量水中，分别用氯仿萃取、弃氯仿层，再用乙酸乙酯反复萃取。收集乙酸乙酯层，减压浓缩干燥后，硅胶柱层析进行分离，用氯仿、甲醇混合液梯度洗脱，获得一较纯组分。获得的组分进行二次硅胶层析，正己烷和丙酮梯度洗脱，在正己烷与丙酮体积比为4:1处获得化合物Ⅱ，并用甲苯和丙酮混合溶液溶解在室温下缓慢挥发得到无色结晶；将正己烷和丙酮体积比为1:1处获得的组分，用反相硅胶层析进一步纯化，洗脱液为甲醇和水，在甲醇和水体积比为3:7处获得黄色粉末并用Sephadex LH-20进行纯化得到化合物Ⅰ，在甲醇和水体积比为1:1时获得无色粉末为化合物Ⅲ。对3个纯化合物进行结构鉴定。

1.2.2 结构鉴定

在美国Clemson大学化学系进行并提供数据。

1.2.3 体外抗氧化能力测定

1.2.3.1 体外清除DPPH自由基清除能力的研究

DPPH自由基(1,1-苯基-2-苦肼自由基)清除能力方法参照Yamaguchi等[7]的报道略作改进。将待测物用甲醇溶解，配成一定浓度，并作梯度稀释。DPPH自由基浓度0.25mmol/L。在试管中分别加入0.5mL待测液和0.5mL DPPH自由基溶液，充分振摇后放于暗处在室温下反应30min然后于波长517nm处测定吸光度。用0.5mL待测液加等体积的甲醇作样品对照，而0.5mL DPPH自由基溶液加等体积的甲醇作空白，测定时用纯甲醇调零。按照公式(1)计算样品对DPPH自由基的清除能力。以BHT作为标准对照。做3次重复取平均值。

1.2.3.2 体外螯合金属的能力

此方法采用Dinis等[8]报道的方法进行适当改进。将FeCl2和Ferrozine试剂分别配成2mmol/L和5mmol/L的溶液，样品处理同1.2.1节。取600μL待测液与40μL FeCl2混合后加入80μL Ferrozine试剂溶液，充分混匀后在室温下反应10min后在波长562nm处测吸光度，同时做用等体积蒸馏水代替待测液做空白，等体积蒸馏水代替Ferrozine试剂做样品空白。用EDTA反应作标准，按公式(2)计算样品的金属螯合能力。

1.2.4 抑菌实验

取7支无菌试管分别加入1mL菌悬液，1号管中加入1mL质量浓度为5mg/mL的化合物溶液，混匀，按照两倍稀释法依次稀释至6号管，从6号管中吸取1mL混合液弃去，7号管做阳性对照，另取一管加灭菌水做阴性对照。这样各试管中药物质量浓度分别为2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078mg/mL，将试管在37℃下培养18h后，从上述试管中各取0.5mL接种于制备好的琼脂培养基上观察菌落生长情况。

2 结果与分析

2.1 绞股蓝分离物结构鉴定

得到的3个化合物中，化合物Ⅰ为一种新的化合物，命名为Ligballinone，化合物Ⅱ得到结晶并经X衍射验证了其结构[9]。化合物Ⅲ为无色粉末，分子式：C18H20O4，相对分子质量300。碳谱及DEPT谱，碳谱上显示有23个碳信号，13C DEPT显示有4个CH2：δ65.43、δ62.54、δ36.13、δ32.81。7个CH：δ129.96、δ128.51、δ126.14、δ116.53、δ110.01、δ88.57、δ55.22。其结构解析如图1所示，核磁数据见表1。δ7.21 2H，d，J＝8.5在HMQC (1J coupling) 图谱上对应的碳δ128.51，其在DEPT上明显是CH，峰强度明显高于其他CH氢谱上积分为两个氢，所以为两个CH重叠。COSY (3J) 谱上显示其与6.79 2H， d， J=8.5 耦合，而此二氢在HMQC上对应的碳谱δ为116.53，DEPT显示其为CH，其峰强度略高于其他CH，两个CH重叠。所以其为标准的对位取代苯环。

由于δ6.79、7.21均为双峰(耦合常数大于5Hz者认为邻位有质子耦合)，二者邻位必为季碳。

图1 化合物Ⅲ结构解析图Fig.1 Structure elucidation of compound Ⅲ

表1 化合物Ⅲ的核磁数据Table1 1H, 13C NMR, DEPT and HMBC data of compound Ⅲ

向外面延伸，两个苯环季环只可能有158.52及134.73两个，如果邻位有羟基会造成化学位移值下降，所以6.79、6.79间的季碳为连羟基季碳158.52，那另一个季碳就是134.73。同时HMBC还有信号，7.21与88.57碳相关，88.57只有与134.73相连。化合物Ⅲ的结构如图2。此化合物曾经报道有合成的[10]，而作为天然产物提取物尚未见报道。

图2 化合物Ⅲ的化学结构Fig.2 Chemical structure of compound Ⅲ

2.2 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的体外抗氧化活性

2.2.1 对DPPH自由基的清除能力

图3 化合物体外清除DPPH自由基的能力Fig.3 DPPH free radical scavenging activity of compoundsⅠ,Ⅱ and Ⅲ

在3个分离得到的纯化合物中，化合物Ⅲ具有较强的清除DPPH自由基的活性，其半抑制率质量浓度为0.026mg/mL。新化合物Ⅰ具有微弱的清除DPPH自由基活性，在实验最高质量浓度1mg/mL时对DPPH自由基的清除率只有29.33%(图3)，而化合物Ⅱ在实验过程中没有显示对DPPH自由基有清除作用。由图3可直观地看出，在质量浓度大于或等于0.2mg/mL时化合物Ⅲ对DPPH自由基的清除率逐渐高于同质量浓度下的BHT。

2.2.2 对金属的螯合能力3个纯化合物对金属离子螯合作用很微弱(图4)。化合物Ⅲ虽然有很强的清除DPPH自由基的作用，但对金属离子的螯合作用却很弱。说明化合物Ⅲ的抗氧化活性体现在对自由基的清除能力较强，化合物Ⅲ对于其他自由基如羟自由基、超氧阴离子自由基等的影响有待进一步研究。

图4 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对金属离子的螯合能力Fig.4 Fe2+ chelating ability of compounds Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ

表2 3种化合物对细菌的抑制作用Table2 Antimicrobial activities of compoundsⅠ,Ⅱ and Ⅲ

2.3 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ抑菌活性

用不同质量浓度的化合物分别对4种细菌做抑菌实验结果见表2。

由表2可见，在实验浓度范围内化合物Ⅱ对变异链球菌有一定的抑制作用，对金黄色葡萄球菌有着较强的抑制作用，而对大肠杆菌和沙门氏菌显示较弱的抑制作用；化合物Ⅲ对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌仅显示出微弱的抑制作用；化合物Ⅰ也显示出与化合物Ⅲ相似的抑菌趋势，但作用更弱。

3 结 论

从绞股蓝中分离出3个木脂素类化合物， 3个木脂素类化合物中只有化合物Ⅲ有较强的清除DPPH自由基的能力，化合物Ⅰ只有微弱的清除能力，而化合物Ⅱ在实验质量浓度范围内没有显示出对DPPH自由基的清除作用，3种化合物对金属的螯合能力在实验质量浓度范围内都很低。

变异链球菌(Streptococcus mutans)是寄生于人口腔中的微生物，是引起人类龋齿的主要微生物之一；金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌是常见的食源性致病菌。3种化合物在一定程度上对4种细菌显示抑制其生长的作用。

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