张朝良 孔祥丽 陈思秀 李小玉

（口腔疾病研究国家重点实验室,四川大学,四川 成都 610041）

牙周病是由以牙菌斑中的微生物为主，多种因素作用所引起的牙周支持组织慢性感染性疾病，是成年人失牙的主要原因[1]。其临床病理特点为牙周软硬组织呈进行性不可逆性的破坏。目前牙周病治疗的最终目的是牙周组织的再生、重建和功能的恢复。牙周膜细胞（periodontal ligament cells，PDLCs）能合成和分泌大量胶原物质，具有多向分化潜能，其前体细胞能分化出成牙骨质细胞、成骨细胞和成纤维细胞，维持牙周组织的相对稳定，是牙周炎治疗后牙周新附着形成的主要细胞来源，是牙周组织再生的基础。目前研究[2]表明，多种生长因子对PDLCs增殖分化和细胞外基质合成有促进作用。

中药黄芪的活性成分黄芪多糖对成骨细胞的体外增殖与分化具有一定作用。黄芪化学成分众多，主要含有多糖类、皂苷类、黄酮类以及氨基酸类等。黄芪中多糖含量为2.53%，相对分子质量为1万～5万。黄芪水提取液中含有3种黄芪多糖（Astragalus membranaceus，APS），即APSⅠ、Ⅱ、Ⅲ。其中APSⅠ是杂多糖，由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖组成，相对分子质量36 300，APSⅡ、Ⅲ均为葡聚糖[3]。因此，本文通过体外培养人牙周膜细胞，观察黄芪多糖对其增殖、分化能力以及结构的影响，以期为口腔生物工程细胞培养提供有效的理论基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM培养基（Gibco公司，美国），小牛血清（Hyclone公司，美国），胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Sigma公司，美国），多聚甲醛、二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）等均购于郑州化学试剂三厂。CO2培养箱（Heraeus公司，德国），倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）。

1.2 人牙周膜细胞体外分离培养

在临床上取得因正畸拔除的健康牙，置含双抗的DMEM培养基中，立即送到实验室，在无菌条件下将牙放入双抗中5～10min，取出在培养皿里除去其他牙龈组织；用PBS洗2次，再用刀片刮取根中部1/3的牙周膜组织，用0.1%Ⅰ型胶原酶3mL冲洗后吸入25mL培养瓶里，置37℃水浴摇床中振摇90min，显微镜下观察有大量细胞游离出来，立即终止消化即加8mL DMEM培养基混匀，吸入离心管中，封口，1 000 r·min-1，离心8min；取出，弃上清，用含20%胎牛血清DMEM 1mL稀释，计数，将细胞数调至每毫升5×106个细胞悬液接种入培养瓶里，10 d后换液，以后每3 d换1次液，20 d后，显微镜下观察有牙周膜细胞贴壁生长；25 d后，用0.25%胰酶原瓶传代1次，继续培养，待细胞融合达80%再传代[4]。

1.3 牙周膜细胞的生物学特性及鉴定

1.3.1 常规观察 选择原代牙周膜细胞及第3代对数期生长的细胞，置显微镜下观察并拍照。

1.3.2 免疫组化鉴定 取第4代培养细胞爬片，用免疫组化ABC法进行波形丝蛋白及细胞角蛋白免疫组化染色。倒置显微镜观察细胞原代及传代后情况。细胞传至5代时，制成每毫升1×105个的细胞悬液并制备细胞爬片。然后按ABC法操作、DAB显色，分别进行波丝蛋白、角蛋白的免疫组织化学染色，以PBS代替抗体作为阴性对照组，显微镜下观察染色结果[5]。

1.4 黄芪多糖对牙周膜细胞的影响

1.4.1 黄芪多糖对牙周膜细胞增殖的影响 牙周膜细胞按每毫升2×104个，每孔0.5mL加入24孔板后，换加入APS的含10%小牛血清的DMEM培养基，每孔0.5mL，使APS最终质量浓度分别为0.08、0.1、0.2、0.4mg·mL-1，继续培养3 d。实验结束前3.5 h，各孔加40 μL的MTT（5 mg·mL-1），37 ℃ ，5%CO2条件下孵育3.5h，弃培养液，各孔加DMSO溶液0.45mL，振摇5min，静置0.5 h后，用酶标仪检测其在570 nm波长处吸光度值。

1.4.2 黄芪多糖对人牙周膜细胞合成碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的影响 试验分为4组：分别加有0.08、0.1、0.2、0.4 mg·mL-1黄芪多糖DMEM培养液，不含黄芪多糖DMEM培养液为对照组，将人牙周膜细胞调整密度至每毫升0.5×105个的细胞悬液后，按每孔1mL接种于6孔培养板中，细胞培养3 d后，弃去孔内液体，用PBS液漂洗每孔3遍，用TritonX-100裂解细胞，然后按照ALP试剂盒检测人牙周膜细胞内ALP的合成情况，酶标仪上450 nm处检测各孔的吸光度值。

1.4.3 黄芪多糖对牙周膜细胞表面结构的影响 将对照组牙周膜细胞和适宜黄芪多糖质量浓度组牙周膜细胞以每孔1×104个的密度接种到预先放有盖玻片的24孔培养板中，3 d后取出盖玻片，固定、脱水、临界点干燥、镀金，扫描电镜下观察。

1.4.4 黄芪多糖对牙周膜细胞超微结构的影响 用0.25%的胰蛋白酶消化对照组和适宜黄芪多糖质量浓度组牙周膜细胞，分别收集于离心管中，15 000 r·min-1离心15min，弃上清，用2%戊二醛固定细胞团块2 h，丙酮梯度脱水，真空干燥，以Epon812包埋，超薄切片后透射电镜观察。

1.4.5 统计学分析 采用Origin 8.0软件完成统计处理，统计数据以均数±标准差表示，各组数据进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牙周膜细胞的生长与鉴定

培养10～15 d，有细胞从组织块周围游出（图1A），成梭形，传代3代后细胞生长旺盛，均为梭形，周围有数个长短不等的突起，中央有圆形或卵圆形的胞核（图1B）。波形丝蛋白和角蛋白染色显示培养细胞波丝蛋白染色阳性，细胞胞浆棕黄色着色（图1C），角蛋白染色阴性（图1D），证实所培养的细胞为中胚层来源的细胞[6]，且无上皮来源细胞的混杂，符合牙周膜细胞的形态学及免疫学特征。结果表明运用消化-组织块法培养获得人牙周膜细胞，细胞来源可靠，生长状态良好，可作为体外的细胞模型用于进一步研究黄芪多糖对其功能的调控作用。

2.2 黄芪多糖对牙周膜细胞增殖和ALP表达的影响

APS质量浓度在0.1～0.2 mg·mL-1范围内，对PDLCs的增殖有促进作用，0.2mg·mL-1时作用最强，此后质量浓度增高反而有抑制作用（图2）。从0.1mg·mL-1质量浓度开始，对ALP表达有促进作用，但当质量浓度达到0.4mg·mL-1时，同样表现出明显的抑制作用（P＜0.05，图3）。

2.3 黄芪多糖对牙周膜细胞结构的影响

牙周膜细胞呈长梭形和多角型，较扁平，细胞表面有细小的绒毛和皱褶，细胞在贴壁生长时生出伪足并黏附（图4A），生长在含有黄芪多糖的培养基中的牙周膜细胞分泌大量的基质沉积于细胞周围（图4B）。对照组牙周膜细胞生长良好，细胞胞质丰富，胞质中见丰富粗面内质网、高尔基器及线粒体等，各细胞器结构正常，细胞核核仁明显，常染色质丰富，部分线粒体肿胀（图5A）。含黄芪多糖培养基中，可见牙周膜细胞胞质内大量肿胀的线粒体（图5B）。

3 讨论

近年来，牙周袋内局部用药特别是应用中草药越来越引起人们的重视。黄芪味甘，性温，有补气升阳、固表止汗、排脓、利水消肿和生肌等功效。临床用黄芪为主药治疗多种疾病，能明显地促进免疫功能的活性，对骨质疏松有显著疗效，因而对骨细胞的生长作用近年来也为人们所重视[7-8]。

本实验观察不同质量浓度梯度的APS对PDLCs的增殖作用。MTT检测法是检测细胞增殖活力的一种简便、准确的方法，主要反映细胞的能量代谢。结果表明0.2mg·mL-1的APS对PDLCs的增殖具有明显促进作用（P＜0.05），而高质量浓度的APS（0.4mg·mL-1）对牙周膜细胞的增殖具有明显抑制作用（P＜0.05）。

体外培养的PDLCs至少存在2种表型：成纤维细胞表型和成骨细胞表型，前者具有较强的合成胶原的能力，后者能发育为成骨细胞或成牙骨质细胞，是牙周组织再生修复并形成新附着的重要成分[9]。ALP是一种细胞膜相关的糖蛋白，在矿化组织细胞中高表达，为成骨细胞的一种特异表型，能水解磷酸酯，为羟磷灰石的沉积提供必需的磷酸，同时水解焦磷酸盐，解除其对骨钙化形成的抑制作用，有利于骨的形成。本研究在含有0.2mg·mL-1黄芪多糖的培养基中，PDLCs碱性磷酸酶的表达明显高于对照组，提示其有促进牙槽骨形成的作用。

在本研究中，生长在含有APS培养基中的细胞形态良好、分泌大量的基质沉积于细胞周围，无细胞衰老及异常分裂现象；从超微结构上看，黄芪能使细胞生理代谢作用增强，细胞线粒体数目增多，体积明显增大，表明细胞在分裂增殖和生物学功能方面处于非常活跃的状态。由此可见，适宜质量浓度APS可促进体外培养人牙周膜细胞的生长和分化，有利于细胞的增殖。

牙周组织的修复是多因素、多方面、多种因子共同调控下完成的。对影响牙周组织细胞的因子还知之甚少，已知因子对牙周组织细胞调控机制的了解还尚不完全，本实验条件下，0.2mg·mL-1APS为牙周膜细胞较适宜的作用质量浓度，以此作用于体外培养牙周膜细胞是口腔组织工程种子细胞体外培养的有益尝试。

[1]Gronthos S,Mankani M,Brahim J,et al.Postnatal human dental pulp stem cells（DPSCs） in vitro and in vivo[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97（25）：13625-13630.

[2]Yazawa H,Zimmermann B,Asami Y,et al.Simvastatin promotes cell metabolism,proliferation,and osteoblastic differentiation in human periodontal ligament cells[J].J Periodontol,2005,76（2）：295-302.

[3]王拥军,宋莉君,孙爱贞,等.黄芪多糖的提取及对体外培养成骨细胞成骨能力的影响[J].中国中医骨伤科杂志,1999,7（6）：1-6.WANG Yong-jun,SONG Li-jun,SUN Ai-zhen,et al.The refine of APS and its effect on the osteogenic capacity of osteoblasts in vitro[J].Chin J Trad Med Traum Orthop,1999,7（6）：1-6.

[4]江龙,朱亚琴.改良组织块法体外培养人牙周膜细胞和牙髓细胞[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2008,18（4）：195-198.JIANG Long,ZHU Ya-qin.Study on human periodontal ligament cells and dental pulp cells with modified tissue culture in vitro[J].Chin J Conserv Dent,2008,18（4）：195-198.

[5]任娟，李霞，孙克勤,等.人牙周膜成纤维细胞的原代培养及鉴定[J].中国药物与临床,2007,（9）：672-673.REN Juan,LI Xia,SUN Ke-qin,et al.The primary culture and identification of human periodontal ligament fibroblasts[J].Chinese Remedies Clinics,2007,（9）：672-673.

[6]许彦枝,杨凤英,罗冬青.中药双黄补对体外培养人牙周膜细胞增殖活性的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13（37）：7341-7345.XU Yan-zhi,YANG Feng-ying,LUO Dong-qing.Effects of Shuanghuangbu on proliferation activity of human periodontal ligament cells cultured in vitro[J].J Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research,2009,13（37）：7341-7345.

[7]Ohta S,Yamada S,Matuzaka K,et al.The behavior of stem cells and progenitor cells in the periodontal ligament during wound healing as observed using immunohistochemical methods[J].J Periodontal Res,2008,43（6）：595-603.

[8]Coura GS,Garcez RC,de Aguiar CB,et al.Human periodontal ligament：A niche of neural crest stem cells[J].J Periodontal Res,2008,43（5）：531-536.

[9]Haase HR,Ivanovski S,Waters MJ,et al.Growth hormone regulates osteogenic marker mRNA expression in human periodontal fibroblasts and alveolar bone-derived cells[J].J Periodontal Res,2003,38（4）：366-374.