曲明阳* 郑永胜 邢光明 赵 莉 李方华 冯秉安

1 大连医科大学附属第二医院普通外科（116027）

2 大连医科大学附属第二医院检验科（116027）

3 大连医科大学附属第一医院神经内科（116011）

右旋柠烯（D-limonene）是从中药橘皮中提取有效单体成分，已经被证明对多种肿瘤具有明显的抑制作用。Fascin-1是一种重要的胞质蛋白，决定着细胞微丝骨架的分布和活动，可能在细胞迁移、侵袭以及细胞间信息交流等过程中发挥作用[1]。本实验将探讨中药提纯单体右旋柠烯对乳腺癌细胞微丝骨架结构的影响及其Fascin-1蛋白相关机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及仪器

右旋柠烯购自美国Sigma公司，纯度97%；Matrigel购自美国Collaborative Research公司；纤维粘连蛋白购自北京大学医学部细胞室；RPMI-1640培养液及MTT为Gibco BRL公司产品；胰蛋白酶为购自美国Sigma公司；小牛血清购自中国联星生物大连公司；Fascin-1单抗为Santa Cruz公司产品；Transwell小室为美国BD公司产品其上Polycarbonate滤膜孔径为8μm；酶标仪及显微镜均为德国Leica公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人乳癌高转移细胞株MDA-MB-435购自中科院上海细胞所，以含10%小牛血清的RPMI-1640常规培养，以处于对数生长期的细胞备用。

1.2.2 共聚焦显微镜下乳腺癌细胞微丝骨架结构

预先置无菌盖玻片于6孔板中，每孔接种104个人乳腺癌细胞MDAMB-435，待24h后确认细胞已经爬片生长，加入不同浓度右旋柠烯常规培养24h，经PBS液漂洗，4%甲醛固定25min后，用含有0.2%Tritonx-100和0.1%BSA的PBS溶液室温下封闭渗透30min，然后在避光状态下将预先配置好的5μg/mL的Phalloidin-FIFC在37℃下孵育1h，对照组用PBS代替。PBS液充分漂洗，PI复染30min，PBS液封片，激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架形态改变。

1.2.3 细胞侵袭实验

在Transwell小室Polycarbonate滤膜上下面分别涂纤维粘连蛋白和 matrigel，风干备用。取不同处理组的MDA-MB-435细胞100μL（2.0×104个）于Transwell小室，37℃温育24h。70%乙醇固定，擦去滤膜内表面细胞，HE染色，以中性树脂封片。在200倍光学显微镜下随机选择5个视野，计数每个视野细胞数目，取其平均值。以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.2.4 Western Blot分析

不同浓度右旋柠烯处理的乳腺癌细胞，更换无血清培养液继续培养24h，收集上清，离心，冷冻干燥。变性后经SDS-PAGE电泳分离，转膜，小牛血清封闭后，分别加入1∶400稀释的一抗，4℃过夜，加二抗及显色剂，检测杂交蛋白，计算条带的积分吸光度（IA）：IA=平均吸光度×面积。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 激光共聚焦细胞微丝骨架结构图像

右旋柠烯作用后，以F-actin为基础的微丝骨架结构发生明显变化，质膜突起和膜皱褶减少，细胞间排列较为规则，细胞基底外侧微刺结构明显减少（图1）。

图1

2.2 右旋柠烯对乳癌细胞侵袭能力的影响

以0.25、0.125、0.0625mmol/L浓度的右旋柠烯预处理乳癌细胞24h后，收集细胞制成悬液进行对重组基底膜的侵袭实验。结果表明，在无毒剂量下，右旋柠烯对乳癌细胞24h侵袭能力具有明显的抑制作用（61.7±8.4、89.3±11.0和105.3±7.7），与对照组（166.1±12.2）比较差异显著（P＜0.05），见表1和图2。

表1 右旋柠烯对乳癌细胞侵袭能力的影响（n=3）

图2

2.3 右旋柠烯对乳腺癌细胞Fascin-1蛋白表达的影响

以0.25、0.125、0.0625 mmol/L不同浓度药物预处理24h后，收集乳腺癌细胞进行Western Blot蛋白免疫印记染色并计算积分光密度。结果显示，相对分子质量为56×103的Fascin-1蛋白表达受到抑制，以高浓度即0.25mmol/L最为明显，各组积分光密度分别为（2.9±0.3）、（12.4±0.7）及（19.3±0.7），与对照组（28.6±0.5）比较差异显著（P＜0.05，图3）。

图3 不同浓度右旋柠烯作用下，相对分子质量为56×103的Fascin-1表达下调

3 讨 论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，转移是其重要致死原因。因此，发现针对性的治疗靶点以及低毒有效的抗转移药物具有重要的意义。细胞微丝骨架重排和其介导的细胞运动、细胞间作用是肿瘤转移领域研究热点之一。F-actin是微丝骨架的主要结构蛋白，其在不同表型肿瘤细胞中分布及表达不同，参与多种肿瘤恶性化转变和转移过程[2]。但F-actin广泛存在于正常细胞和肿瘤细胞中，无组织表达特异性，缺乏临床应用价值。

Fascin-1是一种重要的胞质蛋白，具有与F-actin结合的作用，并决定F-actin微丝骨架的分布和活动[3]。而且，在其他多种以actin为基础的细胞运动相关结构均作为关键结合蛋白出现，发挥重要调控作用[3]。Fascin-1定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶边缘的丝状伪足、微棘中。细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动、肿瘤细胞的转移有密切关系，提示Fascin-1蛋白可能在细胞迁移、侵袭以及细胞间信息交流等过程中发挥作用[2]。对上皮细胞的研究发现，当Fascin-1与F-actin结合，细胞伸出伪足和微棘，在细胞外基质（ECM）上的迁移能力提高。更为重要的发现是，Fascin-1在多种正常组织器官的上皮中不表达或者低表达，而在该部位发生的恶性肿瘤中表达水平却不同程度的提高，因此，Fascin-1在抗肿瘤转移研究中具有重要的实用价值[4,5]。

右旋柠烯是从中药橘皮中提取的有效单体成份，具有广谱的抗癌活性。我们的实验结果表明，右旋柠烯作用后，乳腺癌细胞以F-actin为基础的微丝骨架结构发生明显变化，质膜突起和膜皱褶减少，细胞间排列较为规则，细胞基底外侧微刺结构明显减少。而进一步的体外侵袭实验表明，右旋柠烯可以有效的抑制乳腺癌细胞的侵袭能力，侵袭基底膜细胞数显著减少。提示右旋柠烯可以通过改变细胞骨架结构来调控细胞运动，进而影响其侵袭行为。通过蛋白印迹实验，我们发现，伴随着细胞运动能力和侵袭能力的减弱，Fascin-1蛋白表达显著下降，说明右旋柠烯是通过抑制该蛋白的表达，参与了乳腺癌细胞体外侵袭的调控。

[1]Sun J. D-Limonene: safety and clinical applications[J]. Altern Med Rev,2007,12(3):259-264.

[2]Hashimoto Y. Roles of Fascin in human carcinoma motility and signaling: prospects for a novel biomarker?[J]. Int J Biochem Cell Biol,2005,37(9):1787-1804.

[3]Kureishy N,Sapountzi V,Prag A,et al. Fascins and their roles in cell structure and function [J].BioEssays,2002,24(4):350-361.

[4]Karasavvidou F,Barbanis S,Pappa D,et al. Fascin determination in urothelial carcinomas of the urinary bladder: a marker of invasiveness[J]. Arch Pathol Lab Med,2008,132(12):1912-1915.

[5]Kostopoulou E,Angelidou S,Daponte A.Fascin can be an auxiliary immunomarker of ovarian granulosa cell tumors: comparison with calretinin and inhibin-alpha[J].Eur J Gynaecol Oncol,2008,29(6):638-642.