程丽彩 何玉秀

1郑州大学体育学院（郑州 450044） 2河北师范大学体育学院

葛根素（4，7-二羟基-8-D-葡萄糖基异黄酮，Puerrin，Pur）是一种天然的植物雌激素，主要由豆科植物野葛根中提取获得，并在多种葛属植物中广泛存在。近年来，关于细胞凋亡与神经系统功能关系的研究证实，葛根素对缺血性脑卒中、老年性痴呆、缺血再灌注损伤等中枢神经系统疾病均有神经保护作用，其机制与细胞凋亡有关［1］，但其对运动训练导致的大鼠创伤性脑损伤及学习记忆功能的影响少见报道。

研究发现，运动引起人体细胞凋亡的功能意义是机体部分清除损伤细胞的正常生理过程，是组织自我保护机能的反映［2］，而大量细胞凋亡则会造成组织器官、系统功能下降，有可能是运动性疲劳的机制之一。由于大脑是控制、调节人体随意运动的重要系统，在人体运动过程中起主导作用。大脑海马区与学习、记忆等脑的高级功能以及脑的老化密切相关。本研究通过建立大鼠力竭性训练模型，采用流式细胞仪检测相关数据，观察力竭性运动训练后脑组织海马细胞凋亡以及葛根素补充对于海马细胞凋亡和相关基因Bcl-2、P53蛋白表达的影响，探讨海马细胞凋亡在运动训练导致的机体病理改变中的作用及其分子调控机制，为葛根素作为运动保健品的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象与分组

选取雄性Sprague-Dawley纯种大鼠30只，2月龄，体重240～260g，由河南省实验动物中心提供。大鼠适应性喂养1周后，随机分为3组：安静对照组（C，10只）、力竭训练组（E，10只）和力竭训练+葛根素补充组（PE，10只）。分笼饲养，自由饮水摄食，国家标准啮齿类动物饲料喂养，室温20℃～26℃，每日自然光照12小时。

1.2 实验方案

力竭训练组和葛根素补充组大鼠适应性喂养3天后，进行3天适应性游泳训练，30min/d。正式实验开始后此强度在1周内延长至120min，然后进入力竭性游泳训练期。大鼠于上午进行无负重游泳训练，运动至力竭，1次/d，5d/w，持续训练4周。水温30℃±2℃，水深 70厘米。对于短时间内力竭的大鼠，捞出休息5min后，再进行游泳训练，使训练时间不少于120min。

力竭标准［3］：大鼠沉入水下无法返回水面超过10s；大鼠协调运动消失，在水中不定向乱窜，未达到10s亦定为力竭。

葛根素补充组大鼠从适应性饲养结束后开始灌胃葛根素注射液（北京赛生药业有限公司提供，批号0801153），每天1次，剂量为100mg/kg。对照组及单纯力竭运动组以等量生理盐水灌胃。

1.3 取材

第4周运动结束后取材。取材前大鼠禁食12h以上，训练组停训24h。用2%戊巴比妥钠（2.3ml/kg）腹腔注射麻醉，断头后立即取脑，并迅速在－20℃预冷的托盘上将海马组织分离出来，放入备好的细胞培养液待测，其余脑组织10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，连续切片，切片厚度 5μm，HE染色。

1.4 指标测定

1.4.1 海马细胞凋亡率和增殖指数测定

单细胞悬液制备：取新鲜大鼠海马组织，用眼科剪刀边剪边用PBS液冲洗，直至将组织剪碎。过滤2次，收集细胞悬液，离心清洗2次。显微镜下调整细胞浓度为1×106/ml，制成标准的单细胞悬液［4］。

海马细胞凋亡率测定：取海马单细胞悬液，细胞数控制在 1×106个，离心弃去固定液，PBS清洗 2次，200目筛网过滤1次。用PI一步染色法在4℃冰箱避光染色30min。染色结束用PBS清洗2次，洗去染液，即可上机检测。激发光源为15mW氩离子激光器，激发波长为488nm，应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析，用MuticycleAV分析软件对DNA细胞周期进行分析。

细胞增殖指数测量：应用DNA细胞周期分析软件，计算出DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数（PI）表示细胞的增殖活性，公式为：PI＝（S＋G2M）／（G0/G1＋S＋G2M）×100%。

1.4.2 海马细胞凋亡基因蛋白表达测定

取单细胞悬液100μl，加入鼠抗人Bcl-2单克隆抗体工作液100μl，室温避光孵育30min，洗涤一次，加入羊抗鼠 FITC-IgG二抗工作液 100μl，避光室温孵育 30min，加入PBS10ml离心（同上），弃上清以除去未结合的荧光二抗，加入PBS，经500目铜网过滤后上机检测。

P53测定：同样取单细胞悬液 100μl，先用 P53－FITC进行核抗原标记，再用溴化丙啶（PI）染DNA，避光室温孵育30min，加PBS10ml离心，弃上清，加入PBS上机检测。

1.5 统计学分析

数据均使用Spss 11.5分析，结果用平均数±标准差（）表示，组间差异分析采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察结果

C组大鼠大脑海马细胞排列整齐，形态完整，细胞间质均匀、致密，未见异常改变。E组大鼠海马区细胞胞体增大、细胞核皱缩、染色质凝集并边向集中，染色加深，凝集成块。PE组神经细胞凋亡依然存在，但相比E组，数量大大减少。

2.2 海马细胞凋亡率和增殖指数

由表1可知，与C组相比，E组和PE组海马细胞凋亡率显著升高（P<0.01），E组细胞增殖指数显著升高（P<0.05）。与E组相比，PE组海马神经细胞凋亡率显著下降（P<0.01），增殖指数也呈下降趋势，但无统计学意义。

表1 各组大鼠海马细胞凋亡率、增殖指数比较

2.3 凋亡基因Bcl-2、P53蛋白表达

由表2可知，与C组相比，E组海马神经细胞Bcl-2表达显著下降（P<0.05），P53表达显著升高（P<0.01）。与E组相比，PE组海马神经细胞Bcl-2表达显著升高（P<0.05），P53表达显著下降（P<0.05）。

表2 各组大鼠大脑海马细胞Bcl-2、P53比较

3 讨论

3.1 力竭训练后的神经细胞凋亡

科学系统的运动训练可使机体产生良好的适应，而长期大强度训练，特别是力竭性运动可对机体产生不同程度的损伤，并与机体运动性疲劳和运动后细胞损伤有密切的关系［5-8］。由于大脑在大强度运动时处于相对缺血、缺氧状态，脑组织细胞自由基产生增加，出现神经细胞线粒体钙超载，发生缺血、缺氧性损伤，从而导致脑组织细胞凋亡。

本研究结果显示，力竭训练组大鼠海马神经细胞凋亡百分比明显高于对照组。在HE染色结果中也可见该组大鼠海马神经元出现形态学改变。

3.2 葛根素的神经保护作用

多项研究证明，Pur对于脑缺血导致的中枢神经损伤具有保护作用［9-11］。研究发现，Pur对中枢神经系统的保护作用机制可能有：Bcl-2是线粒体外膜蛋白，能抑制CytoC从线粒体释放，并与蛋白酶活化因子1（Apaf-1）结合以阻止胞质中的CytoC与Apaf-1结合，从而抑制Caspase-9的激活［12］。Bcl-2也可通过结合到线粒体膜关闭线粒体膜通透性转变孔从而阻止细胞凋亡［13］。CytoC是电活动转运蛋白，通常位于线粒体的膜内区域。胞浆内的CytoC激活Caspase-3是引起凋亡的必要条件，而Bcl-2上调对两者促凋亡作用有明显的抑制作用。本实验结果显示，E组大鼠海马神经细胞凋亡率显著上升，PE组则显著下降，而且Bcl-2蛋白表达增强，说明葛根素可以通过上调Bcl-2的蛋白表达抑制细胞凋亡，这与同类研究结果是一致的［14］。

转录因子P53可激活上百种基因表达，这些P53靶基因直接参与细胞周期的调控、DNA损伤的修复，以及细胞衰老、分化及细胞凋亡的调控。Panahian等［15］证实抑制P53基因表达则可抑制神经细胞凋亡的发生，对缺血性脑损害具有保护作用。P53可能通过控制Fas受体的激活或者直接进入线粒体而控制细胞色素C的释放。Fas作为一种重要的促进凋亡的调控基因，属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族，其表达产物具有传递凋亡信号的作用，作为死亡受体的Fas与Fas配体结合可诱导细胞凋亡［16，17］。有实验证实，给予葛根素补充的大鼠缺血再灌注6～48h时Fas表达显著降低，缺血再灌注24～48h时P53表达亦明显减少，且凋亡细胞数也明显减少，提示葛根素具有抗凋亡作用，其机制可能与P53蛋白表达有关［18］。

Pur作为一种异黄酮，具有显著的抗氧化作用，因此Pur也可通过抑制缺血诱导的氧化损伤，清除自由基和诱导细胞死亡的因子，发生细胞保护作用。吴平等［19］实验研究证实Pur能增加大鼠脑组织NOS活性及NO含量，这可能是其发挥作用的机制之一。

细胞流式仪检测分析一个群体细胞DNA倍体与细胞周期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1、S、G2/M期三个细胞峰。增殖指数为S期和G2/M期细胞总和占细胞周期中细胞总数的百分比，代表细胞的增殖活性。本实验结果显示：与E组相比，EP组凋亡细胞数量大幅下降，凋亡率显著降低（P<0.01），而增值指数没有太大变化，G1期细胞减少，S期和G2期细胞数量稳定。这说明葛根素有较强的抑制海马细胞凋亡的能力，可促进G0/G1期细胞进入S期，增强整个细胞的增殖水平，以利于机体的进一步恢复。

4 总结

力竭性运动训练能诱导大鼠海马区细胞凋亡过度增加，造成组织器官、系统功能下降。补充葛根素可以通过上调凋亡基因Bcl-2及下调P53蛋白表达，降低细胞凋亡率，对大脑海马细胞有保护作用，值得进一步研究。

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