朱荣 马延超 许寿生 王瑞元

1温州医学院（浙江 温州 325035） 2洛阳师范学院 3北京体育大学

我们实验室的前期研究证实：大负荷运动后骨骼肌收缩蛋白（actin、myosin）、细胞内骨架蛋白（desmin、titin、nebulin）、膜骨架蛋白（dystrophin、integrin）含量减少，超微结构改变（表现为Z线扭曲、模糊、肌丝排列紊乱等），肌力减弱，发现这与蛋白质的溶酶体、calpain降解途径活性增强有关［1-3］，而细胞内蛋白质降解主要途径——泛素蛋白酶体途径的变化如何呢？国内外研究不多。本实验通过观察大鼠一次大强度运动后腓肠肌3-MH含量、26S蛋白酶体活性及其亚基C2 mRNA表达的变化，初步探讨泛素蛋白酶体途径在运动骨骼肌蛋白质降解的作用。

1 材料与方法

1.1 动作与分组

雄性 SPF级 Sprague-Dawley大鼠 36只，8周龄，体重190g～220g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，随机分为6组：安静对照组、运动0.5小时组、运动1小时组、运动1小时后1小时组、运动1小时后2小时组、运动1小时后6小时组，每组6只。

动物实验经北京体育大学实验动物福利伦理审查委员会同意，并严格按照北京体育大学动物实验室规定执行。屏障环境饲养，温度23±2℃，相对湿度65±5%，昼夜交替时间为12/12小时。每笼4只，自由饮食与饮水。

1.2 运动形式

大鼠购进后安静饲养3天，以适应新环境，然后跑台运动适应 3天（第 1天 10m/min×10min，第 2天 10m/min×15min，第 3 天 15m/min×15min），休息 1 天，分别进行0.5小时、1小时大强度运动（25m/min，5%坡度，相当于75%VO2max）［4，5］。

1.3 取材

各组大鼠按规定时间点称重，用2%戊巴比妥钠0.25ml/100g）腹腔注射麻醉［6］，腹主动脉取血后，迅速分离大鼠右后肢肌肉，取等量的红、白腓肠肌，用锡纸包好，投入液氮中保存。取材完毕后将标本转移至－80℃冰箱保存，备用。

1.4 指标测试

1.4.1 骨骼肌 3-MH 含量检测［7，8］

腓肠肌的处理：称取约50mg肌组织，加入含500μl高氯酸（3.0%）的离心管内，高速匀浆，然后4℃下14000g离心25min，提取上清液，用于高效液相技术检测3-MH含量。

柱前衍生：取50μl上清液至离心管内，加入0.2mM硼酸钠125μl，旋涡振荡，缓慢加入乙睛（含荧光胺1.6g/L）125μl，混匀，静置 5min，加入 70%高氯酸 18μl，盖紧离心管，80℃水浴1小时。冷却至室温，加入3M NaOH含 0.5M MOPS）50μl，使标本液 pH在 6.0左右，即上机分离、检测。

色谱条件：流动相采用10mM磷酸钠缓冲液（含30%乙腈，pH7.5），等度洗脱，流速1.0ml/min，进样量25μl，经 Zorbarx SB-C18 柱（4.6×150mm，5μm，柱温为常温）分离，荧光分光光度计检测，激发365nm，发射460nm。

色谱分离：3-MH的出峰时间约为5.9分钟。

标准曲线：配制3-MH标准液（Sigma公司）的浓度分别为 2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0μmol/ml，按样品处理方法进行测定。利用3-MH标准品的不同浓度（C，μmol/ml）与各自对应的面积（S）建立回归方程。

1.4.2 26S蛋白酶体活性测试

参考 Ventrucci G［9］和 Combaret L［10］的方法，并做改动。

胞浆蛋白提取：取腓肠肌约100mg，加入0.5ml匀浆缓冲液［50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM ATP、10mM Mg-Cl2、1mM DTT、20μM PMSF、250mM sucrose、10%glycrol、proteases inhibitors cocktail（1pellet/50ml）］，高 速 匀浆，然后4℃下15000g离心15分钟，取上清，检测组织蛋白浓度和酶活性。

分析缓冲液配制：50mM Tris（pH7.5），5mM MgCl2，1mM DTT。

26S蛋白酶体活性检测：在黑色专用96孔荧光检测板加入各种试剂（见表1）。用POLARstar Galaxy Microplate Reader（BMG公司）仪器进行检测：激发波长380 nm，发射波长460nm，温度设为37℃，每 5分钟读一次，连续检测1小时，所测读数以每个样品蛋白含量纠正。

表1 26S蛋白酶体活性检测反应体系

1.4.3 26S蛋白酶体C2亚基mRNA表达

用Trizol（invitrogen公司）提取骨骼肌总 RNA，其中加入RNase inhibitor抑制RNA降解，DNaseⅠ消除基因组 DNA，以保证 RNA纯度。取 1μl总 RNA，经 ND-100 Spectrophotometer（Nano Drop公司）紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度。

采用TOYOBO公司的试剂盒进行反转录。反应体系为 5×RT buffer 4μl，dNTP （10mM）2μl，Oligo（dT）1μl，Reverse Tra Ace 1μl，RNase inhibitor 1μl，1μg 总RNA，加 DEPC-treated water至 20μl。反应程序为 42℃ 30min，85℃ 5min，4℃ 5min，-20℃保存待用。

由北京赛百盛基因技术有限公司合成引物，上游引物 5’-AAA GCA AGG CTC AGC GAC AG-3’，下游引物 5’-GGC GAG ATA CGG GAA GTG GT-3’（GenBank M29859），长度 236bp。

采用TOYOBO公司提供的SYBR Green Realtime PCR MasterMix试剂盒在TQTM5实时荧光定量仪（Bio-Rad公司）进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为 cDNA 0.5μl、上下游引物各为 0.5μl、ddH2O 8.5μl、SYBR Green Mix 10μl，总体积为 20μl。反应程序为94℃ 240s，（94℃ 20s，62℃ 20s，72℃ 10s） 重复 45 次。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参，每份样品重复三次，采用相对 CT值定量分析（2-△△CT）。公式如下：△△CT=△CT处理样品－△CT未处理样品，其中，△CT=CT测试指标－CT内参。

1.5 统计学分析

数据用统计学软件SPSS 13.0分析处理，进行单因素方差（One-Way ANOVA）分析，结果用平均值±标准差表示，方差齐时用LSD方法，方差不齐时用Tamhane’s方法，P<0.05为显著性差异，P<0.01为非常显著性差异。

2 结果

测试结果（表2）显示：（1）运动后即刻腓肠肌3-MH含量增加（P<0.01），其中运动0.5小时值最高，为安静水平的3倍（P<0.01），运动后逐渐恢复至安静水平，但运动后6小时又升高，达到安静时的2.3倍（P<0.01）。（2）运动0.5小时即刻，26S蛋白酶体活性升高，是安静时的1.3倍（P<0.05），运动1小时即刻和恢复期活性下降至约安静水平，运动后6小时活性又升高至安静时的1.3倍（P<0.05）。（3）26S蛋白酶体的C2亚基mRNA在运动即刻以及运动后1、2小时表达都低于安静时，并在运动1小时即刻具有显著性（P<0.05），运动后6小时表达突然升高到安静时的2.3倍（P<0.01）。

表2 大强度运动前后大鼠腓肠肌3-MH含量、26S蛋白酶体活性及C2亚基mRNA表达变化

3 讨论

3-甲基组氨酸（3-MH）存在于骨骼肌、心肌的肌动蛋白（actin）和肌凝蛋白（myosin）中［11］，是组氨酸形成组氨酰tRNA后发生甲基化的产物。3-MH一旦从多肽上降解下来便不能作为tRNA的底物合成新肽链，也不会再被分解［12］。检测3-MH含量可以间接反映肌纤维收缩蛋白的降解。大部分人体和动物实验采用尿3-MH含量进行评价，但尿3-MH含量部分还来源于机体其它器官，而测量肌肉3-MH含量可以真实反映骨骼肌收缩蛋白降解的变化。本研究检测了运动后骨骼肌3-MH含量变化，这样的研究还未见报道。我们采用的25m/min跑台速度、5%坡度运动对于大鼠来说相当于75%VO2max的运动强度，运动 1小时后，接近疲劳，与 Hollander等［5］的动物实验一致。本实验结果显示，运动后即刻腓肠肌3-MH含量较安静时显著升高，其中运动0.5小时后即刻3-MH含量比运动1小时多，运动后6小时又非常显著高于安静水平，提示运动中肌肉收缩蛋白降解增加，随着运动时间延长，降解增加的程度减少，在运动后短时间内降至安静水平，但运动后6小时收缩蛋白降解又增加，这可能与肌纤维结构改变、运动能力降低有联系，但很遗憾我们没有观察超微结构变化。

有研究表明，肌肉蛋白质降解可以通过四种途径来完成，即溶酶体途径、calpain途径、caspase途径和泛素蛋白酶体途径［13］。泛素蛋白酶体途径被认为负责细胞内80～90%的蛋白质周转，包括 actin 和 myosin［14］，在肌纤维蛋白降解中具有重要作用。泛素蛋白酶体途径由多种组分构成，即泛素、负责蛋白质泛素化的酶（泛素活化酶、泛素结合酶、泛素连接酶、E4、去泛素化酶）以及26S蛋白酶体。首先，负责泛素化的酶将多个泛素分子与底物蛋白结合，从而标记底物蛋白，然后被26S蛋白酶体识别和降解，途径中任一组分上调都会加强蛋白质的降解。负责降解蛋白质的26S蛋白酶体是一个巨大的胞浆蛋白酶复合物，含多个亚基，由20S蛋白酶体和多种调节复合物（如19S调节复合体）组成，具有多种蛋白酶活性，如类糜蛋白酶活性、类胰蛋白酶活性、谷氨酰水解酶活性、支链氨基酸肽酶活性和中性氨基酸切割活性等，其中类糜蛋白酶位点对多肽的切割是降解26S蛋白酶体降解蛋白质的限速步骤［15］。本研究利用能产生荧光的肽底物——Suc-LLVY-AMC分析腓肠肌26S蛋白酶体类糜蛋白酶活性。结果发现运动0.5小时活性升高，随后降低，运动后6小时又升高，与肌肉3-MH含量变化近一致，提示运动引起的26S蛋白酶体活性的升高可能加强了收缩蛋白的降解。在治疗肌萎缩或因疾病引起的肌消耗症时，常用抑制蛋白酶体活性的药物［16］，但不清楚它是否能减缓大强度引起的蛋白大量降解。不过，国外学者Kee等［17］发现，经过5天训练的大鼠与不训练大鼠都进行一次急性跑台运动后，前者蛋白酶体活性比后者低，认为运动适应可减小肌肉泛素蛋白酶体途径对运动应激的反应，有利于蛋白质合成。

有趣的是，我们发现26S蛋白酶体C2亚基mRNA表达不完全和其活性变化一致，在运动后即刻和短时间子恢复期内mRNA含量较安静水平减少，而运动后6小时非常显著增加至安静时2.3倍。其实，26S蛋白酶体活性不仅受亚基含量影响，还受亚基组装与激活的控制，其基因调控比途径其它组分基因更受严密［18］。在剧烈运动初期，26S蛋白酶体活性提高，一方面可以加快降解错误折叠、氧化损伤等蛋白，以保证细胞正常代谢；另一方面加快一些调节蛋白的降解，改变信号通路调节细胞功能以适应运动应激。但是，过度增强的活性可能会对细胞造成伤害［19］，因此，运动后短时间内 C2亚基基因表达的降低，可能是调控26S蛋白酶体活性的一种方式，以免活性过度升高。所以我们发现由于亚基基因表达持续低下，使得26S蛋白酶体活性在运动0.5小时升高后开始降低，一直到运动后6小时C2基因表达才又明显升高，而此时的蛋白酶体活性也明显增强。这可能是由于细胞外因素变化，如糖皮质激素、TNF-α、IL-1、IL-6等激活细胞内某些信号通路［20-22］，提高了基因的表达，加强了蛋白酶体组装，使蛋白酶体活性增强。运动后蛋白酶体活性的升高，可以加强氨基酸周转，为物质的合成提供能量（禁食的时候）以及为促进运动后蛋白质的重塑提供基础［23，24］。

4 总结

大强度运动后即刻和运动后6小时大鼠腓肠肌收缩蛋白降解增加，可能是26S蛋白酶体活性升高所致，其中26S蛋白酶体C2亚基mRNA表达调控着运动对其活性的影响。

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