张春兰 张克英 丁雪梅 白世平

（四川农业大学动物营养研究所,雅安 625014）

随着饲料加工业的不断发展和世界各地学者对饲料加工方法和程度的研究,饲料原料的粉碎粒度逐渐成为各种动物饲料配制过程中一项极其重要的指标。在实际生产中,许多养殖户偏向于采用细粉碎饲料以增大饲料的利用率并减少浪费,但是饲料原料的粉碎不仅会增加加工成本,而且会降低饲料产量,同时,越来越多的研究证明细粉碎的谷物饲料会引起家畜消化道疾病[1-2]。在家禽上虽然饲料粉碎粒度的研究有很长历史,但大都集中在肉鸡上,且多是关于生产性能的。由于家禽特殊的消化道结构,谷物粉碎粒度是否对家禽消化道产生同样的影响,对饲料流通速率的影响有多大,还需要试验的研究和支持。本试验主要通过研究饲喂3种不同粉碎粒度的玉米制成的玉米-豆粕型饲粮引起产蛋高峰期蛋鸡肌胃溃疡指数、十二指肠组织形态学结构、盲肠菌群及饲料流通速率的变化,进而探讨玉米粒度对蛋鸡消化道生理和饲料流通速率的影响,为进一步发挥饲料物理因素在动物生产中的作用,从而更大程度地发挥饲料加工对动物生产的积极作用提供参考方案。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用玉米从成都汇峰饲料实业有限公司购得,并在该公司采用专业蛋鸡饲料加工设备进行粉碎加工,粉碎机型号为SFSP60×68,功率22 kW,转速2 910 r/min。

1.2 试验动物及饲粮

试验动物选用38周龄罗曼粉壳蛋鸡,基础饲粮配制参照中国蛋鸡饲养标准（1985）中产蛋期产蛋率＞80%的蛋鸡饲养标准。基础饲粮组成及营养水平见表1。

1.3 试验设计与饲养管理

试验动物选用体重及发育相近的774只38周龄罗曼粉壳蛋鸡,本试验采用单因素试验设计,试验饲粮中的玉米为粗、中、细粒度的3种玉米（分别为粉碎后通过5、4&3和3mm筛孔的玉米）。试验共3个处理,每个处理6个重复,每个重复43只鸡。试验时间为16周。动物试验在四川农业大学动物营养研究所教学科研基地进行。采用3层笼养,每笼3只鸡,开放式料槽,乳头饮水器,人工添料,人工光照,自由采食,自由饮水,日常管理及免疫程序按常规进行。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Com position and nutrient levels of basal diets （air-dry basis）%

1.4 样品采集及处理

1.4.1 肠道指标

试验的最后1天09:00每个重复选取1只（共18只）身体健康、体格中等、产蛋正常的蛋鸡,以颈部放血方式屠宰。取出并分离肌胃、十二指肠和盲肠。

肌胃:将除去内容物的肌胃称重,标记后放入10%中性福尔马林固定液中,以备肌胃评分。

十二指肠:取十二指肠中段2 cm,生理盐水冲洗后,迅速放到10%中性福尔马林固定液中,送到组织胚胎实验室制作石蜡切片。

盲肠:分别结扎盲肠的开口端,剪下盲肠,用酒精棉球消毒结扎口,放入已灭菌塑料袋中,装入冰盒,立即送到微生物实验室进行盲肠大肠杆菌和乳酸杆菌的测定。

1.4.2 饲料流通速率

在上述动物养殖试验结束后,从每个重复选1只健康蛋鸡,采用单笼饲养,每个鸡笼配置单独的料槽和水槽,自由采食,自由饮水。基础饲粮同上述试验,各处理试验饲粮由基础饲粮均匀添加0.6%的Cr2O3作为指示剂而得。

预试2 d后进入正式试验,第3天20:00撤去料槽内饲料,第4天08:00更换粪盘,改换均匀混入Cr2 O3指示剂的3种试验饲粮,任其自由采食30 m in,称取剩料重,然后换成不含标记物的饲粮。以笼为单位,喂后8 h内每2 h收集1次粪样,第10、12、16和24小时分别收集粪样,65～70℃鼓风烘干至恒重,回潮,粉碎后制成风干样品,称取粪样重,用于饲料流通速率的测定。

1.5 检测指标及测定方法

1.5.1 试验玉米及配合饲粮粒度测定

依据GB 6971—86《饲料粉碎机试验方法》中附录B《饲料粗细度的筛分测定法》[3],测定饲粮主要原料（玉米和豆粕）及配合饲粮的粒度:将分级筛按6、8、10、14、20、28、40、50、60、80、100、120、160、200、250目筛和底筛顺序由上向下依次放置在摇筛机上,然后准确称取粉碎后的样品100 g置于最顶层筛子上,打开电源,振摇15m in,关上电源,待机器完全静止后,逐一取下分级筛,将每一层筛上物全部收集,称重。几何平均粒度按下式计算:

式中,¯d i为第i层筛子上物料颗粒的几何平均直径（μm）,d i为第i层筛的筛孔直径（μm）,d i-1为比第i层筛孔大的相邻筛子的孔径（μm）,dgw为质量几何平均直径（μm）,W i为第i层筛子上物料的质量（g）,Sgw为质量几何标准差（μm）。

1.5.2 肌胃评分

肌胃去除食糜后,放入10%中性福尔马林固定液中（未去角质层）。

溃疡指数:1分为正常,1.5分为轻度可见灼伤或血点（≤3个）,2分为重度可见灼伤或血点（＞3个）,2.5分为轻度点状溃疡（糜烂直径≤2 mm,≤3个）,3分为重度点状溃疡（＞3个）,4分为深度溃疡（糜烂长度2～3 mm）,5分为深度溃疡伴随可见穿孔。

1.5.3 胃肠道黏膜形态结构指标

将浸泡于固定液的十二指肠制作石蜡切片后在光学显微镜下进行观察和拍照。

绒毛高度:绒毛顶端至绒毛与腺窝生发细胞的交汇处,通常形成锐角。重复10个绒毛,取平均值。

隐窝深度:肠腺底部至两绒毛之间基部开口处的距离,重复10个隐窝,取平均值。

肠壁厚度:肠外部至肌层与黏膜下层交接处的距离（浆膜厚度加肌层厚度）,重复10点,取平均值。

计算各重复十二指肠绒毛高度与隐窝深度的比值（V/C）:V/C=肠绒毛高度平均值/隐窝深度平均值。1.5.4 盲肠微生物

将盲肠食糜用灭菌生理盐水稀释后,旋涡振荡3～5 m in,逐级进行10-3～10-9倍比稀释,各稀释度分别设6个重复,吸取100μL稀释液接种于选择性培养基平皿上。

双歧杆菌:双歧杆菌选择性培养基,37℃厌氧培养48～72 h。

乳酸杆菌:乳酸杆菌选择性培养基,37℃厌氧培养48 h。

大肠杆菌:伊红美兰培养基,37℃有氧培养24 h。平皿培养结束后,根据菌落形态、革兰氏染色进行细菌鉴定。然后选择最适宜的稀释梯度,对这3种细菌进行平板菌落计数,求其平均值,以每克食糜所含细菌数的对数值（lgCFU/g）表示。

1.5.5 饲料流通速率

参照国家标准GB 13088—91来测定粪样中铬的含量。计算Cr2O3的相对回收率和累积回收率。

Cr2O3的相对回收率（%）=100×（粪样中Cr2 O3的含量×粪样重）/（饲粮中Cr2O3的含量×采食量）。

Cr2 O3的累积回收率（%）=100×∑[（粪样中Cr2 O3的含量×粪样重）/（饲粮中Cr2O3的含量×采食量）]。

2．不同部位NEN的SCGN、CgA阳性表达：胃、肠道、胰腺不同部位NEN的SCGN表达率差异无统计学意义，而CgA在不同部位的表达差异有统计学意义(H=0.249，P=0.000，表1)。其中CgA在肠NEN中的表达率显著低于在胃或胰腺NEN中的表达率，差异均有统计学意义(Z值分别为-3.749、-4.214，P值均<0.017)，在胃与胰腺NEN中的表达率差异无统计学意义。

1.6 数据处理

所有数据采用M icrosof t Excel软件进行处理,统计分析采用SPSS 13.0软件对数据进行单因子方差分析,并结合Duncan氏法做多重比较。数据采用平均值±标准误表示。

2 结 果

2.1 试验玉米及配合饲粮粒度测定结果

如表2和图1、图2所示,玉米粉碎通过5mm筛孔的玉米粒度大部分（76%）分布在714～3 348μm;通过4&3 mm筛孔的玉米,其粒度大部分（77%）分布在505～3 348μm;通过3mm筛孔的玉米,其粒度大部分（74%）分布在232～1 844μm。配合饲粮的主要粒度分布与各组粉碎玉米的一致,但配合饲粮中粒度为4～89μm的颗粒所占比例较大。

表2 试验玉米及配合饲粮的平均粒度Table 2 Themean particle size o f corn grains and dietsμm

图1 玉米粒度的分布Fig.1 Corn grains particle size distribution

图2 饲料粒度的分布Fig.2 Dietary particle size distribution

2.2 消化道生理

试验结果如表3所示,玉米粒度越小,肌胃溃疡评分分值越大（P=0.059）,且最小粒度组的溃疡评分显著高于粗粒度组（P=0.027）,而粗粒度组和中等粒度组（P=0.661）、中等粒度组和细粒度组（P= 0.062）之间差异不显著。

玉米粉碎粒度对十二指肠形态发育（肠壁厚度,P=0.078;绒毛高度,P=0.276;隐窝深度,P= 0.159;V/C,P=0.158）有一定影响。具体表现为:粗粒度组的肠壁厚度显著高于细粒度组（P= 0.031）;玉米粒度越大,十二指肠绒毛高度和V/C值越大,而隐窝深度越小,但各处理间差异不显著（P＞0.05）。

表3 玉米粒度对蛋鸡消化道生理的影响Table 3 Effects o f corn grains particle size on gastrointestinal physiology of laying hens

饲粮中玉米粒度对盲肠微生物影响差异不显著（乳酸杆菌,P=0.375;双歧杆菌,P=0.557;大肠杆菌,P=0.055）,各粒度组间盲肠内容物中乳酸杆菌和双歧杆菌数差异均不显著（P＞0.05）,但大肠杆菌数以细粒度组最高,中等粒度组最低,且这2组间差异显著（P=0.020）。

2.3 饲料流通速率

2.3.1 不同时段蛋鸡粪中Cr2O3的相对回收率

如表4所示,玉米粒度对Cr2O3相对回收率的峰值、峰值到来的时间和到达峰值后的降低速度有一定影响,具体表现为:蛋鸡采食后的第2个小时是粪样排泄的初期,所收粪样中的Cr2O3相对回收率并不高,但各处理间差异达到显著水平（P= 0.025）,其中细粒度组极显著高于粗粒度组（P= 0.008）,其余各组间差异不显著（P＞0.05）;从第4小时起,粪样中Cr2O3相对回收率急剧增高,各处理间差异达到极显著水平（P=0.010）,其中细粒度组的Cr2 O3相对回收率达到了该组8个时间段中的峰值（25.38%）,且极显著高于粗粒度组（P= 0.003）,中等粒度组的Cr2O3相对回收率与细粒度组差异不显著（P=0.183）,但显著高于粗粒度组（P=0.049）;在第6个小时,各处理间差异依然显著（P=0.023）,粗粒度与中等粒度组（21.55%、24.63%）都分别达到了该组8个时段中的峰值,且中等粒度组极显著高于粗粒度组（P=0.009）,细粒度组相对第4小时有所下降,但依然显著高于粗粒度组（P=0.033）,而与中等粒度组间差异不显著（P=0.539）;相对于第6小时,在第8小时各组的Cr2O3相对回收率均有所下降,处理间差异也有所减小（P=0.086）,但细粒度组降幅最大（从23.98%降至15.51%）,粗粒度组降幅最小（从21.55%降至20.98%）。所以,玉米粒度与粪样中Cr2O3相对回收率之间的关系产生了变化,与前3个时段相反,在第8小时粗粒度组显著高于细粒度组（P=0.029）,其余各组间差异不显著（P＞0.05）;在第10个小时,各组间差异再次加大（P=0.014）,粗粒度组显著高于中等粒度组（P=0.015）,且极显著高于细粒度组（P=0.007）;在第12小时,含指示剂的饲料大部分已排出消化道,此时各组粪样均开始逐渐由绿色转变为正常颜色,但处理间差异显著（P= 0.034）,其中粗粒度组的Cr2O3相对回收率显著高于中等粒度组（P=0.034）和细粒度组（P=0.017）,而中等粒度组与细粒度组间差异不显著（P= 0.715）;处理间粪样Cr2O3相对回收率在第16小时仍然差异显著（P=0.028）,粗粒度组显著高于中等粒度组（P=0.042）和细粒度组（P=0.011）,而中等粒度组与细粒度组间差异不显著（P=0.520）;在试验的最后1个阶段,含指示剂的饲料在消化道的流通即将结束,粪样中检测到的Cr2O3含量已经很少,各组间Cr2O3相对回收率差异不显著（P= 0.458）。

2.3.2 不同时段蛋鸡粪中Cr2O3的累积回收率

从表5可以看出,各组间Cr2O3累积回收率的差异主要体现在前3个时间段。在饲料刚开始流通的前2个小时,各处理间差异达到了显著水平（P= 0.025）,其中细粒度组极显著高于粗粒度组（P= 0.008）,其余各组间差异不显著（P＞0.05）;在第4 （P=0.005）和6（P=0.002）小时,各组间差异继续加大,第4小时,粗粒度组极显著低于细粒度组（P=0.001）,显著低于中等粒度组（P=0.044）,第6小时,粗粒度组极显著低于细粒度组（P=0.001）和中等粒度组（P=0.006）;在第8（P=0.136）和10 （P=0.678）小时,由于细粒度组饲料流通速率的急剧减缓,各组间差异减小到不显著,但呈现相同趋势:中等粒度＞细粒度＞粗粒度;在最后的3个时段,随着时间增加,Cr2O3的累积回收率趋于平稳,各组间差异均不显著（12 h,P=0.943;16 h,P= 0.699;24 h,P=0.799）。

表4 饲粮玉米粒度对鸡粪中Cr2 O3相对回收率的影响Table 4 Ef fec ts of corn grains particle size on the relative recovery rate o f fecal Cr2O3%

表5 饲粮玉米粒度对不同时段蛋鸡粪中Cr2 O 3累积回收率的影响Tab le 5 Ef fects of corn grains particle size on the cumulative recovery rate of fecal Cr2 O3%

3 讨 论

粉碎玉米的dgw随粉碎机筛孔孔径的增大而增大[4]。混合饲粮粒度大小趋势与各处理粉碎玉米一致,但饲粮的dgw都小于其中的玉米。饲料成品的dgw通常要小于饲料主要粉碎原料的平均粒度,因为大多数矿物饲料、添加剂的粒度较小。

3.1 消化道生理

3.1.1 肌胃溃疡评分

长期以来许多试验证明,饲料粒度过细会导致猪胃溃疡发生。本试验表明玉米粒度过细也可引起蛋鸡的肌胃溃疡,这与高天权[5]的研究结果一致。但是本试验结果发现,蛋鸡因为饲粮粒度引起的肌胃溃疡严重程度远较猪的小,这可能是由肌胃内角质层的保护作用引起的。

3.1.2 十二指肠组织形态结构

小肠的正常结构与功能是营养物质被充分消化与吸收的基本保证,十二指肠作为小肠的第1段,虽然对营养物质的消化吸收较小肠后段弱,但其更重要的生理功能是通过大量绒毛的运动起到搅拌食物的作用,这对小肠后吸收功能的发挥有很重要的意义。十二指肠的肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度和肠壁厚度的变化可以反映出食糜在出胃进入肠道后与肠道的相互作用过程。

W illiams等[6]研究发现饲喂大颗粒饲料能增加食糜在消化道内的运动和回流促进动物消化道的健康。Hedemann等[7]用粗、细粉碎的2种饲料饲喂生长猪,发现饲料粒度的增加有提高小肠绒毛高度的趋势。Gabriel等[8]用整粒的谷物饲喂肉鸡发现该组的小肠绒毛高度/隐窝深度显著高于饲喂粉碎谷物组肉鸡。与此一致,本试验结果表明饲粮中玉米粒度的增加可以改善小肠黏膜层的结构,促进肠绒毛的健康生长。肌胃的酸性环境被认为是阻止病原微生物进入消化道后段的屏障。由于肌胃对细粉碎饲料的碾磨作用较弱,细粉碎饲料在肌胃中停留的时间短因而其与胃酸作用时间较短。在小肠前段这些未被消化的食物上滋生了像大肠杆菌和坏死性肠炎的致病菌——梭状芽胞杆菌这样的病原菌[9]。饲料粉碎过细使得饲料与消化道内微生物接触面积更大,也更有利于有害微生物的生长。与细粉碎饲料相比,使用粗粉碎饲料可以降低沙门氏菌的感染率[10]。十二指肠是小肠中细胞代谢最活跃的一段,肠绒毛受到有害物质的刺激后能够很快导致小肠形态的改变,使细胞周转加快,隐窝加深。同时,大颗粒的饲料对肠壁的刺激较大,可能通过促使肠壁的运动,加强饲料在肠道内的搅拌甚至回流,延长饲料在肠道停留的时间来实现对其更好地消化吸收。本试验中,玉米粒度的增加显著提高了肠壁厚度（肌层厚度加浆膜厚度）,这可能是由于大颗粒玉米通过刺激肠道运动而使肠道的肌肉层增厚。

3.1.3 盲肠微生物

禽类的盲肠是一个重要的发酵场所,其内容物中存在大量的微生物群。正常情况下,盲肠内各种菌群的数量成一定的比例关系,这些微生物区系平衡对宿主消化吸收、阻止入侵病原菌和增强机体免疫有重要作用。饲粮的变化或者消化道机能失调导致进入大肠食糜成份的改变,这都可破坏盲肠内菌群组成,从而对盲肠的免疫及消化功能产生影响。

近年来有一些研究报道了饲料粒度对盲肠微生物的影响。Bjerrum等[11]和Engberg等[12]研究发现细粉碎的饲料能增加禽类盲肠内病原微生物的数量,危害宿主健康。Glünder[13]和Gabriel等[14]研究发现饲料中添加整粒的谷物能增加肠道内乳酸杆菌的数量和减少大肠杆菌数。Santos等[15]认为大颗粒饲料或整粒谷物能促进腺胃胃酸分泌和肌胃运动,这些过程可防止有害微生物进入肠道,从而维护了肠道较好的微生物区系。本试验结果与以上研究不完全一致,中等粒度组的盲肠微生物区系较优,这可能是由于相对粗粒度饲料,中等粒度饲料在盲肠内停留的时间较短,缩短了微生物的发酵时间,减少了大肠杆菌数量,而细粉碎饲料由于增加了食糜与微生物的接触面积,从而使盲肠中有害微生物在适宜的环境中过多繁殖。这说明适当增加饲料中谷物粒度,不仅对动物胃和小肠的健康有益,而且对盲肠内病原微生物也有抑制作用,提高了盲肠免疫功能和饲料消化率。

3.2 饲料流通速率

相对细粉碎的饲料,大颗粒饲料由于与酶接触的表面积较小而使饲料的消化率降低[16]。但许多研究表明饲喂动物粗颗粒饲料有助于动物消化道前段的发育和增强其功能的发挥[2],这样也使得食糜在消化道前段滞留的时间更长,增强了酶的消化作用[17-18]。

从本试验结果看,玉米粒度越小饲料在消化道流速越快,达到排出高峰的时间越短,达到高峰期后,细粒度组排出量迅速减少,与之相反,粗粒度组降低较缓。与玉米粒度测定结果比较可发现,这可能与各组饲粮中较小颗粒的那一部分玉米比例有关。质量几何平均直径较小的玉米中较小颗粒的玉米所占比例较大,这一部分玉米可免于肌胃的碾磨作用而快速地进入小肠,缩短在消化道的滞留时间,而较大颗粒的饲料则会在肌胃中碾磨直至一定尺寸再进入消化道后段,长期饲喂大颗粒饲料的蛋鸡消化道发育较好,更有益于食糜在消化道内较长时间的停留,以弥补大颗粒饲料与消化酶接触面积较小的不足。本试验中检测到各处理饲粮大量排出的时间是在采食后4～8 h,但在Parsons等[17]的试验中是在4～6 h。此差异可能是由于试验方法、饲粮或动物的不同造成的。在粪样检测结果中发现各组间前6个小时的Cr2 O3累积回收率差异最大,在第12小时差异最小,且在6～12 h内粗粒度组的Cr2O3累积回收率一直小于细粒度组,说明相对细粒度组,粗颗粒能使10%左右的饲料在消化道内延长1～6 h的消化时间,而相对中等粒度组,粗颗粒也能使6%左右的饲料在消化道内延长1～6 h的消化时间,这可能与各处理饲料中不能通过2 000μm直径筛孔的大颗粒玉米所占饲料中玉米总量的比例有关。

4 结 论

①饲粮中玉米粒度的增大可降低蛋鸡肌胃溃疡的发生率,改善十二指肠组织形态学结构和盲肠菌群结构。

②饲粮中玉米粒度的增大可减慢饲料的流通速率,增加饲料在蛋鸡消化道中的停留时间。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:zkeying@yahoo.com

（编辑 尚彬如）