张文正 魏开斌

(泰山医学院附属泰山医院骨科，山东 泰安 271000)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)的治疗一直是医学界难题，随着人们对SCI病理生理过程认识的不断深入，各种治疗方法不断取得进展。近年来，细胞移植以其针对继发性损伤的有效性，在SCI治疗的研究中日益深入，显示出良好的应用前景。目前认为治疗SCI有效的载体包括：嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)、神经干细胞(neural stem cells，NSCs)、胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、施万细胞(Schwann cells，SCs)、少突胶质细胞(oligodendrocyte)和星型胶质细胞(astrocyte，AS)等，它们移植治疗SCI都取得了一定的疗效，但也都存在一定的局限性。其中，嗅鞘细胞以其独特的生物学特性，成为治疗脊髓损伤最有前景的细胞之一。基于此，嗅鞘细胞与其它细胞联合移植治疗SCI已经成为研究的热点。本文就其研究进展及应用前景进行综述。

1 脊髓损伤的研究现状

1.1脊髓损伤后的病理变化

SCI后，病变部位发生的病理变化分为原发性损伤与继发性损伤两个阶段。原发性损伤仅局限在损伤处，包括微血管出血、组织缺血、水肿、轴突及神经元坏死等。继发性损伤发生于原发性损伤后较长一段时间内，在SCI处有血液循环的部位进行，包括脱髓鞘、梗死及囊肿形成等，其损伤机制有缺血缺氧、炎症反应、离子失衡(钙超载)、自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性作用、脂质过氧化作用和细胞凋亡等。继发性损伤不仅会损伤残存的神经细胞，而且还会对SCI区边缘的正常组织造成破坏，从而继续加重原发性损伤，使脊髓功能进一步丧失，是导致SCI难以治愈的关键。因此，如何保护脊髓组织、减少甚至预防继发性损伤，进而促进神经元及轴突的再生是基础研究的重点,也是治疗SCI的希望所在。

1.2脊髓再生修复机制

SCI后，由于损伤局部微环境的改变，脊髓神经元上调和表达与轴突修复相关基因的能力不足等诸多因素的存在，使得神经元轴突自我修复能力有限。造成断裂的轴突不能有效再生的原因有：①神经营养因子(NTF)的缺乏；②中枢神经生长抑制因子的存在；③引导系统退化导致轴突不能沿正确方向生长[1]；④成纤维细胞、小胶质细胞、星型胶质细胞和上皮细胞在损伤部位增殖，形成神经胶质瘢痕作为物理和化学屏障阻碍脊髓再生。通过对SCI后影响神经轴突再生因素的研究，我们能够认识到，为SCI区域提供一个适宜受损神经轴突再生的局部微环境，以使其达到功能上的恢复，应该作为SCI修复的重点，而细胞移植便是达到这种目的的一种有效手段。

逆转不利于SCI轴突功能恢复的病理过程，以减少脊髓功能丧失并促进其功能恢复是采用细胞移植治疗SCI的主要目的，主要包括：①填充脊髓空洞，为神经元的再生提供一个细胞附着和生长的场所；②提供新的神经元，以形成新的传导通路和神经环路；③促进轴突再生，包括长距离的再生到达远端和出芽生长形成局部的神经网络；④分泌多种生长因子，提供脊髓轴突再生修复的多种营养因子，如神经生长因子(NGF)、神经营养因子(NT 4/5)、脑源性神经营养因子(BDNF)等。

2 嗅鞘细胞修复脊髓损伤的机制

2.1改变SCI损伤的局部微环境

OECs不仅可以分泌神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经营养因子(NT 4/5)、睫状神经营养因子(CNTF)等多种神经营养因子，还能够表达促进突起生长和参与细胞黏附的分子，如层粘连蛋白(laminin)、神经细胞黏附分子(N-CAM)、含唾液酸的神经黏附分子(BSA-N-CAM)[2]，此外，它还可以分泌胶质源性的神经连接素(nexin)。这些特性为神经轴突的再生建立了良好的局部微环境，有利于损伤轴突的生长、伸长，引导轴突向靶区延伸，促进神经功能恢复。

2.2促进轴突和髓鞘的再生

受损的中枢神经内存在着抑制轴突生长的物质。OECs不仅能够表达多种细胞黏附分子，促进轴突到达靶点，而且还具有伴随生长的轴突迁移的能力；OECs独特的成鞘作用，可以将损伤的神经纤维与其周围的胶质微环境绝缘，从而为轴突生长提供了适宜的微环境。

2.3抑制胶质瘢痕的形成

SCI区的小胶质细胞和星形胶质细胞能够表达原肌球蛋白激酶受体(TrkA、TrkB和TrkC)，OECs可以与之结合，诱导它们分泌大量的胶质源性的神经生长因子并抑制其反应性增生。因此，OECs可以通过抑制胶质瘢痕的形成，间接地促进轴突再生[3]。

2.4帮助神经轴突穿越瘢痕

存在于中枢神经系统内的OECs，可以与中枢神经进行整合，并具有在其内迁移的能力，这就使得OECs所形成的支架桥梁——神经胶质桥，能够穿越再生轴突无法通过的胶质瘢痕，达到相应的靶点，从而恢复损伤的神经功能。

OECs作为治疗SCI最有前景的细胞之一，在抑制空洞及瘢痕形成，促进神经轴突的再生，并使脱髓鞘的神经再髓鞘化等方面有着不可替代的作用。但OECs单独移植，损伤灶局部缺乏神经元，没有足够的神经元替代坏死、凋亡的神经元，仅可促进SCI的有限修复，而不是神经传导束的再生，因而达不到最佳的修复效果。而其它细胞单独移植虽各有其独特的优点，但起不到OECs的作用，因此，将OECs与其它细胞联合移植成为治疗SCI新的研究热点。

3 嗅鞘细胞联合移植治疗脊髓损伤

3.1嗅鞘细胞联合神经干细胞移植

NSCs是一种未分化、多潜能的前体细胞，具有很强的自我更新能力，其子细胞能够分化形成神经系统的各类细胞，且经过多次分裂后仍能稳定地保持其自身特性。

NSCs移植到受损的脊髓后能够分化成神经元和胶质细胞，提供新的神经连接及再髓鞘化，同时分化形成的神经元和胶质细胞可以分泌多种神经营养因子，这些神经营养因子具有改善SCI区局部微环境，促进轴突再生的作用。但NSCs移植修复SCI有其不足之处，OECs可以在一定程度上弥补其不足，两者联合移植修复SCI的机制为：

3.1.1诱导神经干细胞分化形成神经元

在神经系统损伤性疾病中, NSCs虽然参与损伤的修复过程，但其迁移到损伤区后绝大部分分化成胶质细胞。OECs可以分泌大量的细胞黏附分子和神经营养因子，改善损伤区局部微环境，其中， NGF、BDNF、 NT-3、bFGF、GDNF等都被证实能促进NSCs向神经元分化[4]。有研究证实, OECs与NSCs在体外共培养条件下，NSCs主要向神经元分化，其分化形成神经元的比例明显高于血清培养组[5]。在体内将OECs与NSCs联合移植治疗实验动物，发现NSCs分化的胆碱能神经元[6]、多巴胺能神经元数量比NSCs单独治疗组明显增多[7]。

3.1.2促进神经干细胞分化形成的神经元存活及轴突生长

在神经修复过程中, NSCs所分化的神经元，能够替代坏死、凋亡的神经元；同时，存活的NSCs自身也能分泌神经营养因子，但分泌的数量有限。OECs与NSCs联合移植， OECs能够分泌大量的神经营养因子及粘附分子，改善NSCs分化成的神经元生长的局部微环境，促进分化后神经元存活及其轴突延伸。有研究发现[5]，在体外培养实验中，联合培养组NSCs增殖分化明显，分化后的神经元生长活跃，而在NSCs单独培养组中，NSCs明显萎缩，未见增殖分化，1周后死亡。有学者将两者在体内联合移植，移植后12周进行免疫组化检查，发现联合移植组酪氨酸羟化酶阳性的神经元较多，而干细胞单独移植组存活的神经元较少[8]。联合移植的OECs还能分泌大量的细胞粘附分子，这些分子均能促进轴突存活与延伸。Srivastava等[6]将NSCs与OECs共培养基培养，1周后观察，发现联合培养组比NSCs单独培养组ChAT/AchE (胆碱乙酰转移酶/胆碱酯酶)免疫活性神经元的数量明显增多，胆碱能神经元轴突生长得更长。

3.1.3促进神经干细胞分化后与靶细胞发生联系及功能恢复

中枢神经损伤后会在损伤部位形成空洞及以星形胶质细胞为主要成分的胶质瘢痕，而穿越胶质瘢痕是再生神经轴突与靶细胞建立联系的关键。OECs与NSCs联合移植能促进神经轴突再生，包绕并髓鞘化轴突，帮助轴突穿越损伤后形成的瘢痕区达到相应靶点，以使中枢和外周神经之间建立联系。Ramer等[9]认为OECs移植后所建立的局部微环境能抑制空洞形成及胶质瘢痕增生。而Li等[10]则认为OECs与星形胶质细胞胞突相遇后，使后者结构发生改变，在损伤后形成的胶质瘢痕中形成一个通道，诱导再生的轴突从中通过，从而进一步产生功能性连接。

此外，有学者研究发现，联合移植还能更好地修复靶细胞的受体，有利于靶细胞与再生神经元进行信息传递，促进宿主功能的恢复。Srivastava等[6]用红藻氨酸制造大鼠的认知功能障碍模型，发现联合治疗组胆碱能(M型)受体修复最好，与正常接近，M型受体的增多，加强了再生神经元与靶细胞间的信息传递，使再生神经元更好地融入宿主组织，同时，Y形迷宫实验发现联合移植治疗组大鼠的学习、记忆力提高最为明显。

3.2嗅鞘细胞联合胚胎干细胞移植

ESCs是具有自我更新和多向分化能力的多功能性细胞，是从动物早期胚胎内细胞团中分离出来的。在特定的条件下，能够向三个胚层的细胞和组织分化。ESCs经体外培养、诱导分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞的前体细胞后，植入脱髓鞘病变大鼠模型的体内，结果发现ESCs源性的前体细胞可与宿主神经元建立联系并在脊髓和大脑内形成轴突的髓鞘[11]。这一研究为利用ESCs进行移植治疗SCI提供了直接的证据。ESCs治疗SCI的机制是发挥中继作用恢复受损的神经细胞，并促使其轴突形成完整的神经环路。人的ESCs由于其自我更新和多属性而广泛用于移植治疗[12]。

有学者[13]在实验中观察到，OECs与ESCs联合移植组同宿主之间出现了完整的整合, 而其他联合移植组的病理切片上均反映出不同程度的整合不良，在移植物和宿主之间出现囊泡样间隙。OECs同宿主的良好整合能力体现在它能同宿主的血管形成突触小结连接[14]，这有利于OECs长期在宿主体内存活并发挥生物学效应。

另有研究[15]表明，OECs与ESCs联合移植，在OECs分泌的营养因子的作用下，受损的宿主神经元将出现C-Jun高表达，而C-Jun转录因子可能进一步转录编码一些重要的神经元结构蛋白和突触机能重建的重要蛋白，正是C-Jun的高表达导致并维持着轴突的再生，最终同宿主神经元建立突触连接，恢复神经传导功能。

3.3嗅鞘细胞联合骨髓间充质干细胞移植

MSCs是来源于中胚层的具有多向分化能力的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，其中以骨髓组织中含量最为丰富。MSCs最重要的生物学特性就是具有强大的增殖扩增能力，在适当条件下可以分化为大多数体细胞类型。MSCs的多向分化潜能和干细胞特点为SCI的细胞移植和基因治疗提供了新的思路和广阔前景。

与其他细胞相比，MSCs取材方便、容易分离，能够自体移植，然而和其他类型的干细胞一样，MSCs在体内的定向分化也受到SCI病理微环境的影响。Himes等[16]发现将MSCs植入小鼠受损脊髓后,其数量将随时间的推移而逐渐减少。因此,如何使MSCs在体内病理微环境下获得稳定的定向分化以及使移植细胞在体内长期存活是亟待解决的问题。OECs可以分泌多种神经细胞存活和生长所必需的神经营养因子和引导轴突的再生性修复的细胞表面黏附分子，可对其有一定的帮助。

吴立生等[17]进行OECs和MSCs体外联合培养并获得成功，将其移植于SCI大鼠模型，根据Tarlov评分标准评定其脊髓功能恢复情况，结果发现联合移植组各期分数均较单一细胞移植组要高。8周后处死大鼠制作装片，进行免疫荧光染色，发现联合移植组修复情况明显好于对照组。另外，赵廷宝等[18]所在科室已有8例SCI患者接受自体MSCs和异体OECs联合移植，经过1～6个月的随访，所有患者术后均无不良反应，从而证明在临床上OECs和MSCs联合移植修复SCI的可能性。

3.4嗅鞘细胞联合施万细胞移植

SCs是周围神经系统特有的胶质细胞，起源于神经嵴，随着神经轴突的生长而增殖和迁移。SCs能促进轴突再生和髓鞘的形成，OECs能够减少胶质疤痕和空洞的形成，故两者在SCI修复中具有很好的互补作用。有研究表明SCs比OECs修复效果好，不过SCs移植后会产生的抑制作用，这就使其局限在移植区而不能进入宿主组织，只有当OECs移植到SCI周围后，横断脊髓内植入的SCs才能借助于OECs穿越移植区。Fouad等[19]将SCs、OECs和软骨素酶联合植入SCI大鼠体内，结果联合移植组功能获得很大恢复，轴突髓鞘化和纤维网状化效果显著，并根据各自的特性推断其可能是由于SCs为轴突再生提供基础物质，OECs使再生的轴突在损伤区形成连接，软骨素酶减少神经疤痕的抑制作用，从而达到功能上的互补。

3.5基因修饰OECs的移植治疗

神经营养因子在促进SCI恢复中起着重要作用，可以保护神经细胞并减少其损失，促进髓鞘形成和轴突再生。目前临床上主要通过静脉注射神经营养因子的方式治疗SCI，但神经营养因子是生物大分子，难以通过血脑屏障，而且全身使用效率低。基因治疗可将神经营养因子基因导入体内，在局部长期产生神经营养因子，具有局部浓度高、分泌的时间、空间可调控等优点。2003年，Ruitenberg等[20]将腺病毒载体介导的、经脑源性神经营养因子、神经营养素3目的基因修饰的OECs移植到SCI处，发现经基因修饰的OECs不仅能有效地促进轴突生长，还能促进后肢功能的恢复。刘锦波等[21]将脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰的OECs植入大鼠SCI处，结果显示经BDNF修饰的OECs对神经元存活和轴突再生的作用明显强于未经修饰的OECs。有学者[22]将体外非病毒载体介导神经营养因子-3(NT-3)基因转入OECs，并将其移植到大鼠受损的脊髓处，发现OECs能有效促进轴突再生并促进损伤脊髓的功能恢复。

3.6其它联合移植

闫慧博等人[23]证实OECs移植联合IN-1抗体可促进损伤的脊髓神经轴突的存活和再生，较单纯应用OECs或IN-1能更好的促进脊髓损伤修复和大鼠后肢功能恢复。张纯等人[24]应用ChABC联合移植OECs治疗SCI，可得到较好疗效，明显优于单一细胞移植治疗。王路等人[25]认为OECs+LiCliCl比单一OECs移植可以更明显的促进神经纤维再生，对SCI的修复作用更加显著，二者具有良好的协同作用关系。

4 前景及展望

OECs移植治疗SCI虽存在不足之处，但前景仍十分广阔。治疗SCI所需的移植细胞类型极其复杂、并且要求移植细胞具有功能多样性，这就需要以OECs为主的多种类型的细胞联合移植，恰当的细胞联合移植治疗SCI将会取得更显著的效果。基因修饰的OECs移植是新发展起来并极具前景的治疗策略。

虽然OECs联合移植治疗SCI有着巨大的发展潜力，但同时存在一些问题却阻碍其在临床上的应用，如联合移植的定向分化诱导，微环境中神经营养因子的调控，如何控制各细胞的最佳比例，如何把握移植的时机和数量，联合移植的安全性及功能恢复的评价标准等都是亟待解决的问题。另外，由于伦理问题，多种细胞来源受到限制，也阻碍其研究进展。虽然细胞联合移植治疗SCI在实验中取得良好效果，但临床应用还很少，必须加大研究力度。

因此，今后研究的重点为：(1)进一步了解OECs的特性；(2)将OECs与干细胞、组织移植相结合，弥补其不足；(3)采用基因工程技术，用各种载体将神经营养因子基因修饰OECs，提高其修复能力；(4) 采用组织工程技术，利用天然或人工可降解材料为支架，优化修复环境；(5)采用科学有效的评价方法，评估OECs联合移植治疗SCI的临床疗效。总之，开展实施细胞联合移植的研究，仍然任重而道远。

[1] Gomez M, Hernandez ML, Pazos MR, et al. Colocalization of CB (1) receptors with L1 and GAP-43 in forebrain white matter regions during fetal rat brain development: Evidence for a role of these receptors in axonal growth and guidance[J]. Neuroscience, 2008, 153(3):687-699.

[2] Tsuru M，Nagata K，Ueno T，et al．Confocal laser microscopy of chondrocytes that received gene transfer using in vitro electropora[J]．Kurume Med，2002，49(1)：1-5．

[3] Tsuchida H，Hashimoto J，Crawford E，et al．Engineered allogenetic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats[J]．J Orthop Res，2003，21(1)：44-53．

[4] Choi KC, Yoo DS, Cho KS, et al. Effect of single growth factor and growth factor combinations on differentiation of neural stem cells[J]. J Korean Neurosurg Soc, 2008 , 44 ( 6 ):375-378.

[5] 唐洲平,王萍,康慧聪,等.嗅鞘细胞对神经干细胞增殖分化的影响[J].中华实验外科杂志, 2005, 22 ( 9 ):1123-1124.

[6] Srivastava N, Seth K, Khanna VK, et al. Long-term functional restoration by neural progenitor cell transplantation in rat model of cognitive dysfunction: co-transplantation with olfactory ensheathing cells for neurotrophic factor support[J]. Int J Dev Neurosci, 2009, 27 ( 1 ): 103-110.

[7] Shukla S, Chaturvedi R, Roy N, et al. Enhanced survival and function of neural stem cells-derived dopaminergic neurons under influence of olfactory ensheathing cells in parkinsonianrats[J]. J Neurochem, 2009, 109 ( 2 ): 436-451.

[8] Agrawal AK, Shukla S, Chaturvedi RK, et al. Olfactory ensheathing cell transplantation restores functional deficits in rat model of Parkinson’s disease: a cotransplantation approach with fetal ventralmesencephalic cells[J]. Neurobiol Dis, 2004,16 ( 3 ): 516-526.

[9] Ramer LM , Au E, RichterMW , et al. Peripheral olfactory ensheathing cells reduce scar and cavity formation and promote regeneration after spinal cord injury[J]. J Comp Neurol, 2004,473 ( 1 ): 1-15.

[10] Li Y, Li D, Raisman G. Interaction of olfactory ensheathing cells with astrocytes may be the key to repair of tract injuries in the spinal cord: the pathway hypothesis[J]. J Neurocytol, 2005, 34 ( 3-5 ): 343-351.

[11] 冯世庆,王沛.组织细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展[J].天津医药, 2003, 31(6): 407-409.

[12] Tzu-I Chao, Shuhuai Xiang, Chi-Shuo Chen,et al. Carbon nanotubes promote neuron differentiation from human embryonic stem cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 384(4): 426-430.

[13] Li Y,Field PM,Raisman G.Regeneration ofadultratcorticospinalaxons induced by transplanted olfactory ensheathing cells[J].J N eurosci,1998,18 (24):10514-10524.

[14] Bartolomei JC,Greer CA.Olfactory ensheathing cells:bridging the gap in spinalcord injury[J].N eurosurgery, 2000,47(5):1057-1069.

[15] Broude E,McAtee M,Kelley MS,et al.Fetalspinalcord transplants and exogenous neurotrophic support enhance C-Jun expression in mature axotom ized neurons after spinalcord injury[J].Exp Neurol,1999,155(1): 65-78.

[16] Himes BT, Neuhuber B, Coleman C, et al. Recovery of function following grafting of human bone marrow-derived stromal cells into the injured spinal cord [J]. Neurorehabil Neural Repair, 2006, 20 (2):278-296.

[17] 吴立生,吴仕峰.细胞联合移植修复大鼠脊髓损伤的可行性[J].中国组织工程研究与临床康复, 2008,12(34):6626-6630.

[18] 赵廷宝,卢兆桐,赵凌云,等.骨髓间充质干细胞与嗅鞘细胞联合移植治疗脊髓损伤的早期观察[J].中国矫形外科杂志, 2006,14 (5):346-348.

[19] Fouad K, Schnell L, Bunge MB, et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord[J]. J Neurosci, 2005, 25(5):1169-1178.

[20] Ruitenberg MJ,Levison DB,Lee SV,et al.NT-3 expression from engineered olfactory ensheathing glia prom otes spinal sparing and regeneration[J].Brain, 2005,128(Pt4):839-853.

[21] 刘锦波,顾卫东,龚爱华,等.脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰的嗅鞘细胞移植对大鼠损伤脊髓的保护作用[J].中华实验外科杂志, 2006, 23(5): 637-638.

[22] Wu J, Sun TS, Ren JX, et al. Exvivo non-viral vector-mediated neurotrophin-3 gene transfer to olfactory ensheathing glia: effects on axonal regeneration and functional recovery after implantation in ratswith spinal cord injury[J].Neurosci Bull, 2008, 24(2): 57-65.

[23] 闫慧博,鲁凯伍.OECs移植联合IN-1抗体修复急性脊髓损伤的实验研究[J]. 中国临床解剖学杂志,2008, 26(2) :158-162.

[24] 张纯，贺西京.硫酸软骨素酶ABC联合嗅鞘细胞移植修复大鼠亚急性脊髓损伤的实验研究[J]. 中国修复重建外科杂志,2009, 23(1): 8-13.

[25] 王路，王吉兴.嗅鞘细胞与氯化锂联合修复成年大鼠急性脊髓损伤的实验研究[J]. 神经解剖学杂志,2009, 25(3): 317-322.