李 娟 亓文波

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016； 2.泰山医学院附属泰山医院内分泌科，山东 泰安 271000)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)常见的并发症，是DM全身性微血管病变表现之一，是DM患者的主要死亡原因之一。近年来DM的患病率呈直线上升趋势，且由于治疗方法的改善，生存时间的增加，从而肾脏及其它并发症也增加。目前中国尿毒症的第二大原因是DN，而在发达国家及国内的一些发达地区(如上海市)DM已成为肾功能衰竭的主要原因。随着人类基因组计划的提前完成以及后基因时代的到来，有关基因之间、蛋白质之间及基因与蛋白质之间的相互作用对基因表达的影响、蛋白质翻译后加工和蛋白质自身特有活动规律等蛋白质组学的研究成为科学界面临的新的问题。其为探讨DN发病机理、早期诊断方法展现了又一崭新的前景。

1 蛋白质组学

蛋白质组(proteome)的概念是由澳大利亚学者Wihans和Williams等[1]于1994年提出，指的是一个给定的细胞、组织、器官或完整的生物体拥有的全部蛋白质,是一个基因组内所有基因表达的全部蛋白质。生物功能的主要体现者是蛋白质，而与基因组相比,蛋白质组具有多样性和可变性。蛋自质组的种类和数量在同一机体的不同细胞中是不相同的，即使是同一细胞，在不同时期、不同条件下，其蛋自质组也是处于不断改变之中，因此，它是一个动态的概念。

随着蛋白质组的提出，蛋白质组学(proteomics)也就随之产生。其为一门以蛋白质组为研究对象,以全面的蛋白质性质为研究基础,在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式及功能联系等方面进行探索的科学[2]。 现阶段蛋自质组学的研究内容大致可以分为两大类：即结构蛋自质组学和功能蛋自质组学。前者的主要研究方向包括蛋自质氨基酸序列及三维结构的解析、种类分析及数量确定。后者则以蛋自质的功能和相互作用为主要研究目标。

蛋白质组学研究技术包括蛋白质的分离技术、蛋白质鉴定技术和蛋白质组信息学的发展。蛋白质分离技术主要包括：双向凝胶电泳、层析技术、毛细管电泳技术、差异凝胶电泳等。其中双向凝胶电泳技术(2-DE)于1975年提出[3]，至今其在分离蛋白质研究中具有不可替代的作用，其原理为：第一项基于蛋自质等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦(Isoelectric focusing);第二项则根据分了量大小不同进行SDS-PAGE分离，把复杂蛋自质混合物中的蛋自质在二维平面上分开。实现蛋白质分离后，需要对单一蛋白质进行鉴定。常用的方法是将感兴趣的蛋白质进行降解后进行肽段质谱指纹分析即质谱分析，与已知蛋白质的序列信息进行比较和鉴定。目前常用的鉴定技术有基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)和表面增强激光解吸飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)等。之后与蛋白质数据库的信息进行比对以获取、深入分析信息,并指导更深层的功能蛋白质学研究。

近年来，蛋白质组学技术在对正常肾脏及其肾病研究中的应用逐渐增多。其对了解肾脏的生理功能，肾病的病理机制及其诊断标志物，识别新的治疗靶点有深远的意义。

2 正常肾组织及尿液蛋白质组学的研究现状

Sarto等[4]研究了组成人类肾脏的蛋白质的种类,发现单纯应用2-D凝胶电泳可以发现至少2 000种不同的蛋白质,对其中的47种蛋白质进行了鉴定。但该研究中肾脏表达丰富的蛋白质可能掩盖了微量蛋白,而且蛋白质表达的具体部位也无从得知。而肾脏皮质和髓质具有完全不同的生理功能，因此可以想象它们的蛋白质表达谱必定不同。Arthur等[5]分析比较了大鼠肾脏皮、髓质中蛋白质表达的异同，获得了1095个肾皮质和885个肾髓质蛋白。其中,成功鉴定的蛋白质有72种,有10种在皮质大量表达, 6种在髓质大量表达。Witzmann等也进行了相似的研究，发现有127种蛋白质在皮、髓质中的表达有明显差异。由于肾脏结构的多样性和功能的复杂性,分别研究肾脏中不同结构的蛋白质表达对于了解肾脏生理具有十分重要的意义。Yoshida等[6]试图构建正常人的肾小球蛋白质图谱，从近1600个可视蛋白点中鉴定了100余个蛋白质。Ransom等[7-8]分析了肾脏足细胞的蛋白质组成,发现在足细胞表达的106种蛋白质中,有88种呈特异性表达。而Hoffert等[9]比较了大鼠髓集合管(MCD)细胞和非MCD细胞的蛋白质组成,发现有50种蛋白质在IMCD细胞呈高丰度表达,其中10种在MCD细胞的表达量是在非MCD细胞中的2倍以上。

尿液因其无创性优点成为近年来研究的热点，而正常情况下尿液的蛋白质组成反映了肾小球和肾小管的功能。Marshall和W illiams[10]使用染色沉淀方法分离蛋白,成功建立了正常人尿液蛋白的2-D凝胶图谱,但是未进行进一步的分析鉴定。Thongboonkerd等[11]采用丙酮沉淀和超离心方法分离蛋白质,并利用MALDI- TOF -MS鉴定了其中67种蛋白。Spahr等[12]采用LC-MS/MS技术从正常人尿液中成功分离了蛋白质组份,共获得124种蛋白和表达序列标签(EST)翻译产物。Schaub等[13]应用SELDI-TOF- MS分析健康人中段晨尿,发现女性尿液的肽谱各有不同,而男性之间不存在这种差异。Wittke等[14]还联合采用毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)和电喷雾飞行质谱(electrospray time-of-flight MS)方法分析了正常人尿液蛋白。虽然这些技术都具有高通量优点,但对蛋白质的进一步鉴定和定量分析所存在的困难限制了其在临床中的应用。然而尿蛋白质组学技术仍不失为一种发现新的生物学标志物的良好的筛选工具。

3 蛋白质组学技术在其他肾脏病理研究中的应用

蛋白尿是肾脏疾病最常见的临床表现之一。Musante等[15]使用两种不同的层析和电泳技术，证实了局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)患者蛋白尿的产生与循环中的某种“渗透因子”或‘FSGS因子”损伤了肾小球滤过膜有关[16]的假设。其实验确定了10种血浆渗透因子，一步分析鉴定出其中的6种因子，分别是fibulin、载脂蛋白J、玻璃粘蛋白、白蛋白单体、γ-纤维蛋白原及甘露聚糖-结合植物血凝素-相关丝氨酸蛋白酶。 最近Gonzalez等[17]又研究了单核细胞在原发性肾病综合征(INS)发病中的作用。Gonzalez发现，仅有INS患者的单核细胞出现L核丝、 а-原肌球蛋白、膜联蛋白-Ⅲ上调，而这些蛋白均参与了细胞骨架的重排，并使细胞之间的粘附性增加。

尿毒症是慢性肾功能不全的终末期。研究发现尿毒症毒素多为30 kD的小分子蛋白，是肾衰竭患者死亡的主要原因。Ward等[18]应用2-DE和MALDI-TOF-MS比较了尿毒症超滤液和正常血浆蛋白表达的差异，共发现6种特异性蛋白的21种形式参了尿毒症毒素的组成，包括微球蛋白、抗胰蛋白酶等。这些研究表明蛋白质组学是探索尿毒症毒素的一个有力工具，为更好的研究尿毒症的病理生理过程提供了坚实的技术平台。

肿瘤蛋白质组学在蛋白质组学的各种亚学科中的发展最为成熟。泌尿系肿瘤,无论是膀胱癌还是肾细胞癌,均有了较多的研究成果。Rasmussen等[19]用蛋白质组学方法确定了膀胱磷状细胞癌(SCC)患者尿液中出现的124个多肽。在已鉴定的蛋白质中,牛皮癣素只出现于SCC的尿液中,而在移行细胞癌患者和健康人的尿液中均不出现。因此尿液牛皮癣素(或结合其它指标)的检测可能成为早期检测SCC的生物标记物。对肾细胞癌(RCC)的研究中，Sarto等[20]发现RCC患者肾组织中表达Mn-超氧化物歧化酶的2种寡聚和5种单体形式,而健康人肾脏中只表达2种单体形式,无寡聚形式。但是,至今还未证实哪种指标可以作为检测RCC的生物标记物。

发现各种肾小球疾病的生物标记物是蛋白质组学在肾脏病领域最富成果和最具临床应用价值的研究。Thongboonkerd等[21]应用2-DE比较了几种不同肾小球疾病(糖尿病肾病、FSGS和Ⅴ型狼疮性肾炎)患者和健康人的尿液蛋白质成分,发现不同病种的尿蛋白成分区别很大,共有25种蛋白质表达有明显差别。与健康人比较,肾炎患者尿液中的白蛋白、转铁蛋白、 а1-抗胰岛素的含量较多,而激肽原和phorbolin-3含量相对较少。仅在FSGS患者尿液中明显增加的蛋白质有猪型生长激素(第193号)和一种尚未鉴定的蛋白质(第230号)。黄艳军等[22]应用2-DE对肾病综合征中激素耐药型和激素敏感型患儿的尿蛋白进行比较，发现19个蛋白质点表达有明显差异。对19个差异蛋白点进行MALDI-TOF质谱分析，鉴定出12个蛋白质。

肾移植术后患者需要尽量避免反复的肾活检。因此,寻找一种损伤较小、能够经常进行的检查方法对肾移植术后急性排斥反应做出早期诊断具有重要的应用价值。Clarke等[23]和Schaub等[24]采用SELDI-TOFMS技术对几组不同患者的尿液蛋白质进行检测,发现有几组蛋白质特异地出现于急性排斥反应患者的尿液中,很可能作为急性排斥反应的诊断标记物。但是由于SELDI-TOFMS技术的局限性,未能分离鉴定这几种蛋白质。Hampel等[25]应用凝胶电泳蛋白质组学技术进行了类似实验,发现肾移植术后肾功能稳定患者和急性排斥反应患者的尿液蛋白质模式确有不同。使用ESI-MS和MOLDI-TOFMS技术,进一步将β2-微球蛋白、视黄醇结合蛋白和碳酸酐酶确定为诊断急性排斥反应的候选标记物。Tomosugi等[26]用LC-MS/MS分析了急性排斥反应患者的血清蛋白质组成,认为质量/电荷单位为11685 m/z的蛋白质可以作为急性排斥反应诊断的候选指标。

4 蛋白质组学在糖尿病肾病中的应用

虽然有关DN的研究取得了很大的进展,但其发病的分子学机制尚未完全清楚,而蛋白质组学技术为深入研究DN发病机制提供了全新的方法。Thougboonkerd等[27]利用蛋白质组学技术对120 d的OVE26转基因鼠肾组织蛋白质表达的变化进行了研究, OVE26转基因鼠具有人类1型糖尿病(T1DM)的特点，这种DM模型是通过胰岛β细胞钙调素的过量表达产生的,且在出生后数小时内即可发生DM。其他的表现有低胰岛素血症、高脂血症、蛋白尿和人1型DN早期肾组织病理改变极其相似的特点。研究发现了30种已知蛋白的差异表达,包括蛋白酶、蛋白酶抑制因子、凋亡相关蛋白、氧化应激调节因子、钙结合蛋白、转运调节因子、细胞信号蛋白和平滑肌收缩元件等。这些改变的蛋白中,19种在先前的报道中发现对DM有调节作用,而另11种蛋白的作用尚不清楚。其中两种蛋白是弹性蛋白酶ⅢB和弹性蛋白酶抑制剂(EIA),弹性蛋白酶ⅢB表达减少而EIA表达增加,两者共同作用的结果导致弹性蛋白在DM鼠中肾脏的沉积。这些资料首次提出DN涉及肾弹性蛋白和弹性蛋白酶途径。然而,这种途径在DN致病中的作用和功能意义尚不清楚。

目前临床上除微量蛋白尿外,缺乏更特异的DN早期诊断的临床指标。近年来，随着蛋白质组学技术在生物医学领域的广泛应用，研究者已经开始利用蛋白质组学技术筛选能更早、更准确地预测或诊断DN的生物标志物，从而真正达到对DN的早期诊断和防治。

Kim等[28]采用2-DE和ESI-Q-TOF MS/MS技术对单纯2型糖尿病(T2DM组)、合并微量蛋白尿(MA组)及合并慢性肾功不全(CRF组)患者血清蛋白质组学进行了研究,提出谷胱甘肽过氧化物酶( extracellular glutathione peroxidase,eGPx)和载脂蛋白E (apolipoprotein, ApoE)可能作为DN诊断的生物标志物,并对T2DM及合并微量蛋白尿患者血清中eGPx表达进行了进一步研究。

Out等[29]对Pima印第安T2DM患者进行的10年前后的对照研究证实,可以利用尿蛋白质谱预测T2DM患者是否发展为DN。作者选取10年后发展为DN及未发展为DN的Pima印第安T2DM患者各31例,两组患者初始肾功能正常,不合并微量蛋白尿。利用SELDI-TOF-MS技术对两组患者基线水平及10年后尿蛋白质组进行了分析,发现了714种蛋白质,其中12种蛋白质对DN的发生有预测作用,准确性89% (敏感性93%,特异性86% ),而糖化血红蛋白无预测作用。虽然还需要对12种特异性蛋白的作用进行进一步研究,但该结果提示尿蛋白质谱技术可用于预测T2DM患者是否发展为DN。

Meier等[30]应用CE联合质谱技术对44例5年以上病程的T1DM患者和正常对照组的尿蛋白质组学进行了分析,发现了1000多种多肽,其中55种仅在T1DM患者尿中存在,另有88种多肽在早期DN患者尿中的表达与正常对照有差异。作者认为这类高通量技术的应用,有利于将来能更早、更准确地把DN高危个体从DM人群中筛选出来。

随着蛋白质组学技术在DN研究中的广泛应用,将有利于我们更深入、全面了解DN的发病机理，发现特异性、敏感性高的DN诊断的生物标志物。同时，在不同时期或治疗后，监测肾、尿和血浆蛋白质组的系列变化也有助于DN新的靶目标的治疗，从而真正实现对DN的早期、个体化诊断和治疗，最大程度保护肾功能,减少终末期肾脏病的发生。

[1] Wilkins MR,Sanchez JC,Cooley AA,et al.Progress with proteome projects:why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it[J]. Biotechnol Genet ENG Rev,1996,13:19-50.

[2] James P. Protein identification in the post-genome era:the rapid rise of proteomics[J]. Q Rev Biophys,1997,30(4):297-331.

[3] 0’Farrell.High resolution two-dimensional gel ElectroPhoresis of Proteins[J]. J Biol Chem，1975，250:4007.

[4] Sarto C, Marocchi A, Sanchez JC, et al.Renal cell carcinoma and normal kidney protein expression[J]. Electrophoresis,1997,18: 599-604.

[5] Arthur JM, Thongboonkerd V, Scherzer JA,et al. Differential expression of proteins in renal cortex and medulla: a proteomic approach[J]. Kidney Int, 2002, 62: 1314.

[6] Yoshida Y, Miyazaki K, Kamijo K,et al. Proteome database of normal human glomerulus two-dimensional electrophoresis profiling and constructing of XML-based database[J]. J Am Soc Nephrol, 2003, 14 (Suppl): 283A.

[7] Ransom RF, Eicher T, Devillez A,et al. Proteomic analysis of protein expression altered by glucocorticoids in cultured murine podocytes[J]. J Am Soc Nephrol, 2003, 14 (Suppl): 582A.

[8] Ransom RF. Podocyte proteomics in Thongboonkerd V, Klein JB (eds): Proteomics in Nephrology[J]. Contrib Nephrol Basel Karger, 2004, 141: 189.

[9] Hoffert JD, Van Balkom BW, Chou CL,et al. Application of Difference Gel Electrophoresis (DIGE) to the Identification of Inner Medullary Collecting Duct Proteins[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2004,286: F170.

[10] Marshall T, Williams K. Two-dimensional electrophoresis of human urinary proteins following concentration by dye precipitation[J]. Electrophoresis, 1996, 17: 1265.

[11] Thongboonkerd V, McLeish KR, Arthur JM,et al.Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation[J]. Kidney Int,2002, 62: 1461-1469.

[12] Spahr CS, Davis MT, McGinley MD,et al. Towards defining the urinary proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. I. Profiling an unfractionated tryptic digest[J]. Proteomics, 2001,1: 93.

[13] Schaub S, Wilkins J, Weiler T, et al.Urine protein profiling with surface-enhanced laser-desorption/ionization time- of- flight mass spectrometry[J].Kidney Int, 2004,65: 323-332.

[14] Wittke S, Fliser D, Haubitz M,et al. Determination of peptides and proteins in human urinewith capillary electrophoresis-mass spectrometry, a suitable tool for the establishment of new diagnosticmarkers[J]. J Chromatography A, 2003, 1013: 173.

[15] Musante L,Candiano G，Bruschi M,et al. Characterization of plasma factors that alter the permeability to albumin within isolated glomeruli [J].Proteomies，2002,2 (2):197-205.

[16] Candiano G,Musante L,Bruschi M,et al. RePetitive fragmentation products of albumin and alphal-antitrypsin in glomerular diseases associated with nephrotic syndrome [J].J Am Soc Nephrol,2006, 17 (11):3139-3148.

[17] Gonzalez-Buitlago JM,Ferreira L,Lorenzo I.Urinary proteomics [J] .Clin Chim Acta,2007,375(1-2):49-56.

[18] Ward RA,Brinkley KA. A proteomic anaylysis of proteins removed by ultafiltration during extracorporeal renal replacement threrapy [J].Contrib NePhrol,2004,4:280-291.

[19] Rasmussen HH, Orntoft TF, Wolf H,et al. Towards a comprehensive database of proteins from the urine of patients with bladder cancer [J].Urol, 1996, 155: 2113.

[20] Sarto C, Deon C, Doro G, et al. Contribution of proteomics to the molecular analysis of renal cell carcinoma with an emphasis onmanganese superoxide dismutase[J]. Proteomics, 2001, 1:1288.

[21] Thongboonkerd V, Klein JB, Jevans AW,et al. Urinary proteomics and biomarker discovery for glomerular diseases in Thongboonkerd V, Klein JB (eds): Proteomics in Nephrology[J]. Contrib Nephrol Basel Karger, 2004, 141: 292.

[22] 黄艳军,陈荣华.儿童激素耐药型肾病综合征差异表达蛋白的筛选和鉴定[J].中华儿科杂志,2008,22 (10):777-779.

[23] Clarke W, Silverman BC, Zhang Z,et al. Characterization of renal allograft rejection by urinary proteomic analysis[J]. Ann Surg, 2003,237: 660.

[24] Schaub S, Rush D, Wilkins J,et al. Proteomic-based detection of urine proteins associated with acute renal allograft rejection[J]. J Am Soc Nephrol,2004, 15: 219.

[25] Lapin A, Kopsa H, Smetana R,et al. Modified two-dimensional electrophoresis of urinary proteins for monitoring early stages of kidney transplantation[J]. Transplant Proc, 1989, 21: 1880.

[26] Tomosugi N, Yamaya H, Sato K,et al. Serum proteome profiles in acute renalallo graftrejection by ProteinChip analysis[J]. J Am Soc Nephrol, 2003, 14 (Suppl): 431A.

[27] Thongboonkerd V, Malasit P. Renal and urinary proteomics current applications and challenges[J]. Proteomics,2005, 5: 1033-1042.

[28] Kim HJ, Cho EH, Yoo JH, et al.Proteome analysis of serum from type 2 diabetics with nephropathy[J].J Proteome Res, 2007,6: 735-743.

[29] Out HH, Can H, Spentzos D, et al.Prediction of diabetic nephropathy using urine proteomic profiling 10 years prior to development of nephropathy[J].Diabetes Care, 2007, 30:638-643.

[30] Meier M, Kaiser T, Herrmann A, et al.Identification of urinary protein pattern in type 1 diabetic adolescents with early diabetic nephropathy by a novel combined proteome analysis[J]. J Diabetes Complications, 2005, 19: 223-232.