陈伙辉　汪森明　陈燕武　陈广幸　吴凤坚　张　健

【摘要】 目的 探讨结肠癌患者Wnt信号通路的变化情况及其作用意义。方法 利用Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片对结肠正常黏膜组织和癌组织基因表达谱进行检测，分析Wnt信号通路基因表达变化情况。 结果 Wnt信号通路中FRP、Frizzled、CK2、p53、PP2A、CKIα、JNK、CaMKII、CaN、c-jun、cyc-D等关键基因均呈下调，调控着细胞周期、基因转录等。结论 Wnt信号通路可能是调控结肠癌演变过程的重要信号通路之一。

【关键词】 结肠癌; Wnt信号通路; 基因芯片お

The changes and and roles of Wnt signaling pathway in colon cancer patients

CHEN Di-hui,WANG Shen-ming,CHEN Yan-wu.

The Second Peoples Hospital of Zhaoqing, Guangdong 526020, China

【Abstract】 Objective To study the changes and roles of Wnt signaling pathway in colon cancer patients.Methods The Human Genome U133 Plus 2.0 Array were used to analyze gene expression profiles in colon cancer and normal tissues.The genes related to Wnt signaling pathway were selected through genechip data analyasis.Results The key genes related to Wnt signaling pathway of FRP, Frizzled, CK2, p53, PP2A, CKIα, JNK, CaMKII, CaN, c-jun, cyc-D were down regulation, which controled the cell cycle and gene transcription of the vascular endothelial cell. Conclusion Wnt signaling pathway may be one of the most important pathway to control the development of colon cancer.

【Key words】 Colon cancer; Wnt signaling pathway; Genechip

结肠癌是我国常见恶性肿瘤之一，早期症状不明显，无特异性，晚期表现为大便习惯改变，早期诊断、有效地判断病情的发展、评估预后对降低结肠癌病死率十分重要。而进一步深入研究结肠癌发生机制，是更好防治结肠癌的必要基础。近年研究发现Wnt(果蝇无翅基因wingless与小鼠基因Int-1的缩合)信号途径调节控制着许多生命过程，参与细胞的癌变、增殖、分化、凋亡等^[1-2]。Wnt信号通路与结肠癌之间的关系研究有待进一步深入探讨。本实验旨在探讨Wnt信号通路与结肠癌形成的部分分子作用机制，以期为结肠癌的临床防治提供一种新的方法。

1 资料与方法

1.1 组织标本与分组 所有病例标本均取自肇庆市第二人民医院内窥镜室纤维结肠镜摘除活检标本，所有标本均得到患者的知情同意，所有患者检查前均未接受化疗、放疗或其他针对肿瘤的治疗。所取标本一部分在离体后60 s内迅速放入冻存管，置入液氮罐保存。其余所有标本均经病理组织学观察证实。根据病检结果分为正常组织组（A组）和结肠癌组（B组），每组各纳入3例标本。

1.2 基因表达谱芯片检测 TRIzol一步法提取上述2组标本总RNA，并进行纯化和质检。以各组总RNA为模板合成双链cDNA；体外转录生成生物素标记的cRNA;纯化和片段化处理后，取10 μg cRNA与Human Genome U133 Plus 2.0 Array进行杂交、洗脱、染色扫描检测信号。

1.3 芯片图像的采集与数据分析 采用Affymetrix扫描仪进行扫描。差异表达基因的判断标准为：change为I，Ratio≥1，实验组Detection为P的为上调基因；change为D，Ratio≤－1，对照组Detection为P的为下调基因。

1.4 pathway查询分析 通过kegg pathway database (www.genome.jp/kegg/)查询B vs A的差异基因参与的pathway信号通路。

2 结果

2.1 股静脉组织的总RNA提取及电泳图 各组股静脉组织总RNA的OD260/OD280介于1.8～2.0之间，行琼脂糖凝胶电泳，28SRNA和18SRNA条带整齐，28S与18S的吸光值之比约为2，制备的总RNA样品合格（图1）。

2.2 差异基因表达

2.2.1 概况 见表1。

2.2.2 pathway查询结果 主要涉及了Wnt、MAPK、Focal adhension、Toll-like等多个信号通路。Wnt信号通路上游基因FRP；通路下游基因CK2、p53、PKA、PP2A、β-catenin、CKIα、Rac、CaMKII、CaN以及通路末端基因fra-1、cyc-D均呈上调差异表达；而Wnt信号通路上游基因PLC则呈下调状态。图中是B vs A对比的差异表达基因映射入Wnt信号通路结果，红色代表基因表达上调，蓝色代表基因表达下调（图2）。

3 讨论

结肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，随着生活水平的提高和饮食习惯的改变，其发病率呈逐年上升的趋势^[3]。在过去的几十年，许多新药和新方法的综合应用使得结肠癌患者的生存率有了相当的提高。但结肠癌的转移与复发仍然是临床上面临的主要难题，是治疗失败的主要原因。所以很有必要对结肠癌发生的分子机制进行深入研究。既往的研究表明结肠癌的形成是一个涉及多基因，多系统的疾病^[4,5]。这些基因构建成庞大的信号转导系统，影响着肿瘤的演变状态。

细胞外各种刺激通过相应介质与细胞膜上相应受体结合后诱发细胞内一系列级联反应，使细胞增殖分化或周期停滞，构成细胞信号转导系统。Wnt信号通路有3条主要分支^[6-9]：①经典的Wnt-β-catenin-LEF/TCF通路。这条通路激活后将募集细胞内β-catenin，后者活化转移人细胞核，与转录因子LEF/TCF等共同作用激活特异基因的转录；②细胞极性通路。调控细胞骨架的重排；③Wnt/Ca2+通路，通过钙依赖性激酶、钙调蛋白和转录因子NF-AT起作用。β-catenin不能被GSK-3β磷酸化，避免β-catenin经泛素一蛋白酶体系统降解，导致β-catenin在细胞质内聚集，聚集到一定量后转位到胞核中，与转录因子TCF/LEF结合而激活下游靶基因的转录，引起细胞增殖加快、凋亡抵抗。在此系统中，癌基因的激活和抑癌基因的失活刺激细胞加速增殖与无限生长或抑制凋亡，导致肿瘤发生。有研究表明^[10,11]：Wnt-β-catenin通路调节TCF/LEF基因在一些肿瘤中广泛被过度激活，例如黑素瘤、肝细胞癌、毛囊癌、成神经管细胞瘤等；对Wnt通路的组分结构功能以及相互作用的研究，发现Wnt-β-catenin与TCF的结合位点与APC、cadherin和Axin不同，可以为分子药物设计提供潜在的靶位，该通路的抑制剂可能成为新的抗癌前体药物。

本实验研究之信号通路显示，差异表达之基因均呈现下调趋势，有FRP、CK2、p53、PKA、PP2A、β-catenin、CKIα、Rac、CaMKII、CaN、fra-1、cyc-D、PLC等。这些基因通过网络传递信息，相互协调、相互调控。FRP为Wnt信号通路的上游基因，在机体受到外界的刺激后，呈现下调抑制状态，调控影响着下游基因，如CK2、p53、PKA、PP2A、β-catenin、CKIα、Rac、CaMKII、CaN等，而这些基因将不同信号传导通路介导的信号加以整合,起着多种信号的交汇点或共同通路的作用。末端效应基因如fra-1、cyc-D等基因异常表达，调控细胞的细胞周期和基因转录等，进而影响细胞生长状态与功能。

本实验提示：结肠癌发生有多个基因表达的异常表达，通过所编码的蛋白质表达质与量的改变，使细胞的生长调控失常，代谢状态异常等，最终导致了细胞的生长失去正常调控，向恶性转化。临床上如干扰其中的转导途径，就有可能预先中止肿瘤的发生或者减轻肿瘤的危害程度，从而为临床结肠癌的防治提供新的方向和靶点。

参 考 文 献

［1］ Macheda ML, Stacker SA.Importance of Wnt signaling in the tumor stroma microenvironment. Curr Cancer Drug Targets,2008,8(6):454-465.

［2］ Chou FS, Wang PS, Kulp S, et al. Effects of thiazolidinediones on differentiation, proliferation, and apoptosis. Mol Cancer Res,2007,5(6):523-530.

［3］ Bass AJ, Meyerhardt JA, Chan JA, et al. Family history and survival after colorectal cancer diagnosis. Cancer, 2008,112(6):1222-1229.

［4］ Lopes EC, Valls E, Figueroa ME, et al. Kaiso contributes to DNA methylation-dependent silencing of tumor suppressor genes in colon cancer cell lines. Cancer Res, 2008 ,68(18):7258-7263.［5］ Solmi R, Lauriola M, Francesconi M, et al. Displayed correlation between gene expression profiles and submicroscopic alterations in response to cetuximab, gefitinib and EGF in human colon cancer cell lines. BMC Cancer,2008 ,8(8):227.

［6］ Major MB, Camp ND, Berndt JD, et al.Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science,2007,316(5827):1043-1046.

［7］ Adell T, Thakur AN, Müller WE. Isolation and characterization of Wnt pathway-related genes from Porifera. Cell Biol Int,2007,31(9):939-949.

［8］ Goodwin AM, Kitajewski J, DAmore PA. Wnt1 and Wnt5a affect endothelial proliferation and capillary length; Wnt2 does not. Growth Factors,2007, 25(1):25-32.

［9］ Funato Y, Michiue T, Terabayashi T, et al.Nucleoredoxin regulates the Wnt/planar cell polarity pathway in Xenopus. Genes Cells,2008 ,13(9):965-975.

［10］ Castiglia D, Bernardini S, Alvino E, et al. Concomitant activation of Wnt pathway and loss of mismatch repair function in human melanoma. Genes Chromosomes Cancer,2008,47(7):614-624.

［11］ Yamashita T, Budhu A, Forgues M, et al.Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma. Cancer Res,2007,67(22):10831-10839.