罗　兰　袁忠林　孟昭礼　江崇焕　彭正云

摘要对崂山茶树病害种类进行了调查，同时以茶云纹叶枯病为靶标菌进行生防菌的筛选研究。调查结果表明，崂山茶场的主要病害为茶云纹叶枯病、茶赤叶病和茶轮纹病；从茶树上分离得到5种生防菌，对茶云纹叶枯病菌均有一定的抑制作用，初步鉴定为芽孢杆菌（Bacillus spp.），为茶园病害的防治提供了新途径。

关键词茶树；病害种类；调查；拮抗细菌；筛选

中图分类号 S435.711 文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）03-0112-02

茶叶是人们喜欢的健康饮料，具有清心明目、生津止渴的功效，是世界三大饮料（可可、咖啡、茶叶）之一。中国茶叶种植面积居世界第一，产量居世界第二，品质第三，创汇第四。造成这种状况有多种因素，农药的不合理使用是农药残留超标的主要原因。而农药残留是当前茶叶出口创汇最大的卫生质量问题[1]。要解决茶叶中农药残留问题，根本措施是合理使用化学农药防治茶园病虫害，研制高效、无公害农药。而科学使用农药的前提是了解当地茶园的病虫害的发生情况。崂山绿茶产区地处崂山山脉，具有独特的地域特点，纬度高，受海洋气候影响较大，形成崂山绿茶特有的品质，味浓、香高和耐冲泡等显著特点，深受消费者的欢迎[2，3]。同时崂山的气候特点，也决定了茶园病害的发生特点。笔者对崂山茶树病害种类进行调查，旨在摸清本地茶树病害的种类，以期为茶园病害综合治理提供科学依据。

1材料与方法

1.1茶园病害种类调查

在茶树生长季节，采取随机调查的方法，在茶园采集病害标本，并记录病害危害部位及发生程度，参考相关文献进行茶树病害种类鉴定[4，5]。

1.2茶树主要病害病原菌的分离与鉴定

根据病害症状，采集病叶，按常规方法分离病原菌，即在病叶的病健交界处取2~3mm组织块，每病斑3~5块置于培养皿中用70%的酒精消毒30~60s，然后用无菌水洗净3~4次。经无菌吸水纸吸去多余水分，置于PDA上25℃培养，2d后检查分离情况，并进一步纯化。依据培养性状、形态观察和致病性确定病原菌，斜面保存备用[6]。

1.3拮抗菌的分离与纯化

采集不同品种（龙井、福安和福鼎）茶树的根、茎、叶等组织切碎，称量10g放到盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡30min后，再依次稀释为10-2、10-3、10-4等3个浓度梯度，每个浓度重复3次。在NA上培养48h后观察，挑取不同形态、色泽、大小的菌落在NA培养基上纯化培养后转到斜面培养基上保存，备用。

1.4拮抗菌的筛选与初步鉴定

将纯化后的细菌分离物在NA平板上28℃培养24h，用双向平板对峙法筛选对茶树云纹叶枯病菌有拮抗作用的细菌。在PDA平板的四周接上细菌分离物，平板中央接种培养48h，茶树云纹叶枯病菌菌丝块直径为4mm，每处理重复4次，28℃培养3~5d，观察抑菌圈的产生情况，并对有抑制作用的细菌测量抑菌带的宽度、病原菌的菌落直径，计算拮抗菌的抑制率。抑菌作用的大小以抑菌带和抑制率表示[7]。

抑菌带是指在对峙生长中生防菌和靶标病原真菌之间形成的一种透明带。

抑菌率（%）＝[（对照的病原菌落半径-对峙培养中病原菌菌落半径）/对照的病原菌落半径]×100

拮抗细菌的鉴定通过革兰氏染色以及菌体的形态进行，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为阳性菌，大肠杆菌（Escherichia coli）为阴性菌，具体参考沈萍等[8]运用的方法。

2结果与分析

2.1崂山茶园病害种类调查结果

2006~2007年对不同田块茶园分别进行茶树病害的系统调查，结果见表1。通过调查发现，有9种病害在崂山地区发生，其中茶云纹叶枯病为崂山茶园的主要病害，茶炭疽病、茶赤叶斑病为次要病害。叶部病害发生普遍，根部发生较少。

2.2茶云纹叶枯病的分离与鉴定

从茶云纹叶枯病的病叶上分离获得的分离物，通过在显微镜下观察病原菌的菌丝和孢子以确定茶云纹叶枯病菌，采用孢子悬浮液回接到茶树叶片上，保湿48h，10~15d后，对发病的叶片再一次进行病菌的分离。通过分离纯化以及致病性测定确定分离物即为茶树云纹叶枯病菌。

茶云纹叶枯病主要危害叶片，以成叶为主，病斑初为黄色水浸状，后期颜色加深，有波浪形波纹，病斑中央为灰白色，上生小黑点，沿轮纹排列，病斑多在叶尖或叶缘发生。病斑上的小黑点为分生孢子盘，分生孢子为单胞。

2.3拮抗细菌的筛选与鉴定

从茶树根际土壤和茎叶等健康组织中分离得到细菌131株。以茶云纹叶枯病菌为靶标菌一共筛选出了5种抑制率大于50%的拮抗细菌，编号分别是L1、L2、L3、La和Lb。其中，以La的抑制效果最佳，抑菌带宽度和抑菌率分别达到0.72cm和77.3%。其他4株拮抗菌对茶云纹叶枯病菌也有一定的效果，其抑制率分别为71.2%、54.8%、52.0%和65.5%（见表2）。

对5株拮抗菌进行了培养性状和形态鉴定，La、Lb、L1、L3等4个菌株的菌落是凸起的，而L2的菌落是平展的；在5株拮抗菌中仅有Lb产生红色色素，其余4个菌株不产生色素。5株拮抗菌细胞均为长杆状且产生芽孢，通过革兰氏染色均为是革兰氏阳性菌（G+）。初步鉴定认为，这5株拮抗菌为芽孢杆菌（Bacillus spp.）。

3结论与讨论

茶树病害在我国各地均有不同程度地发生和危害，对茶叶的产量和品质有一定影响。据不完全统计，全世界已有记载的茶树病害达380多种，常见的约有30多种。通过对崂山茶场的茶树病害的系统调查，摸清了崂山茶场的主要病害为茶树云纹叶枯病，同时茶炭疽病和茶赤叶斑病也有一定程度发生。茶树叶部病害发生较为普遍，根部和枝部病害发生较少，这和冯明祥等[8]的报道一致。在调查中还发现不同茶树品种对不同病害抗性不同，可以种植抗性品种进行病害的防治。这些结论为进一步制定崂山茶园病害的综合防治措施提供了依据。

茶叶无公害生产，关键性技术是要解决好病虫害防治与农药残留的矛盾，以期获得优质和高产的茶叶。绿色农药的研究与开发是解决农药残留问题的根本措施之一，所以研究和利用拮抗菌来防治茶树病害有着良好的应用前景[9]。本研究从茶树的根际和叶围分离获得了5株芽孢杆菌，对茶树云纹叶枯病菌具有较好的抑制作用，具有作为生防菌的潜能。这些菌株的作用机理、活性物质等还有待进一步研究。

4参考文献

[1] 陈宗懋.解读世界各国制订的茶叶中农药最大残留限量（MRL）标准及其应对措施[J].中国植保导刊，2007，27（9）：30-33.

[2] 汪东风，杜德红，江晓红，等.崂山绿茶微生物污染情况及控制关键技术[J].茶叶，2004，30（1）：40-42.

[3] 胡维军，侯君合，刘学才，等.崂山绿茶不同产区茶园土壤与灌溉水安全质量分析[J].山东农业科学，2007（2）：83-85.

[4] 陈雪芬.茶树病虫害防治[M].北京：金盾出版社，1996.

[5] 陈宗懋，陈雪芬.茶树病害的诊断和防治[M].上海：上海科学技术出版社，1990.

[6] 方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998.

[7] 罗兰，袁忠林，陈茎.小麦全蚀病菌拮抗细菌的筛选及鉴定[J].莱阳农学院学报，2006，23（3）：205-207.

[8] 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验（第3版）[M].北京：高等教育出版社，1996.

[9] 冯明祥，王佩圣，姜瑞德.崂山茶区茶树病虫害记述[J].中国茶叶，2002，24（2）：14-15.

[10] 卢东升，吴小芹.茶园有益微生物及其微生态效应研究进展[J].信阳师范学院学报（自然科学版），2005，18（1）：117-121.