奚鸿杰，华迪，蔡舒玥，谢佺，邱玲，林建国

1 南京医科大学药学院，南京 211166；2 江苏省原子医学研究所

恶性肿瘤是严重威胁我国居民健康的重大公共卫生问题之一。正常情况下，生物体内的细胞增殖和凋亡维持动态平衡状态［1-2］。细胞增殖失控或凋亡受阻可导致恶性肿瘤的发生，而通过调控信号通路或相关蛋白表达诱导细胞凋亡是许多抗肿瘤药物的主要作用机制之一［3-5］。然而，传统的细胞凋亡检测或评价方法，如TUNEL 法和肿瘤细胞形态学观察，存在操作流程繁琐、医生主观判断差异、各种原因所致假阳性结果等局限性，有可能使患者错过最佳治疗时机［6］。因此，早期动态监测细胞凋亡对恶性肿瘤治疗效果评估以及指导后续治疗具有重要意义。分子影像是一种新兴的无创显像技术，能够可视化单个分子或特定细胞亚群，从而反映活体状态下分子水平变化。常用的分子影像技术，如近红外荧光显像具有灵敏度高、响应速度快的特点，正电子发射计算机断层显像（PET）具有灵敏度高、组织穿透力强等优点，如今已广泛应用于生物医学研究以及药物研制等领域［7-8］。半胱天冬酶3（Caspase-3）是细胞凋亡的半胱天冬酶级联反应过程中至关重要的死亡执行蛋白酶，能够启动细胞内蛋白的特异性降解，从而诱导细胞凋亡，是引起细胞凋亡的关键酶［9-10］。因此，设计靶向Caspase-3 的分子影像探针，能够实时监测治疗过程中肿瘤部位Caspase-3表达，精准评估治疗效果，从而为个体化治疗提供可靠依据。本文结合文献就Caspase-3 分子影像探针在肿瘤细胞凋亡监测中的应用进展作一综述。

1 Caspase-3分子影像探针概述

Caspase-3 是细胞凋亡的半胱天冬酶级联反应过程中至关重要的死亡执行蛋白酶，主要由细胞应激引起的内源性途径和细胞外信号诱导的外源性途径激活。活化的Caspase-3可通过酶解凋亡抑制物、细胞外基质及骨架蛋白和裂解DNA 修复相关分子的方式诱导细胞凋亡［9］。因此，Caspase-3 可作为重要的分子靶点用于细胞凋亡显像，从而实现对治疗效果的实时评估。

近年已设计出许多靶向Caspase-3 的分子影像探针，根据与Caspase-3 不同的作用方式，主要分为Caspase-3 抑制剂类和Caspase-3 多肽底物类分子影像探针，见表1。Caspase-3 抑制剂类分子影像探针能够与Caspase-3 结合，通过显像信号改变来检测Caspase-3 活性，如［18F］ICMT-11、［123/125I］-FITI。Caspase-3 多肽底物类分子影像探针则是基于Caspase-3特异性识别多肽底物天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（DEVD）设计的，能够靶向凋亡细胞并被Caspase-3 剪切而释放显像信号，如Bio-DEVD-HCy、［18F］CP-18。

表1 Caspase-3分子影像探针类型、结构及显像方式

2 Caspase-3抑制剂类分子影像探针在肿瘤细胞凋亡监测中的应用

Caspase-3 抑制剂类分子影像探针具有靛红磺胺、肽醛、N-亚硝基苯胺等基团，其结构中缺电子的羰基可与Caspase-3高亲和性结合，随后通过探针中标记的放射性核素或荧光基团进行显像［11］，通常用于检测治疗后Caspase-3表达。

2.1 ［18F］ICMT-11 ［18F］ICMT-11是在化合物靛红磺酰胺的结构上进行修饰，左侧引入苯基醚的氟取代基团，在保持该化合物对Caspase-3高选择性和高亲和力的同时，提高其生物稳定性。随后，在其N-1侧引入1，2，3-三唑并通过2-氟乙基叠氮化物在铜催化下发生环加成反应，使用18F 进行放射性标记［12］。［18F］ICMT-11 具有较高的放射化学产率和代谢稳定性，可与高表达的Caspase-3特异性结合并显像凋亡的肿瘤细胞。有研究在纤维肉瘤细胞和黑色素瘤细胞荷瘤小鼠中发现，［18F］ICMT-11 在体内无脱氟现象，可从心脏和未经治疗的肿瘤组织中迅速清除；在分别使用顺铂和多西环素治疗后，荷瘤小鼠肿瘤组织能够观察到清晰的PET 显像信号，并且Caspase-3表达和对探针的摄取显著升高［13］。与目前已应用于临床的［18F］FDG 相比，在治疗6 h 后就可通过注射［18F］ICMT-11 进行PET 显像，观察Caspase-3 表达，能够较早地验证肿瘤细胞凋亡，表明该探针在临床检测Caspase-3 和疗效评估方面具有巨大潜力。此外，注射［18F］ICMT-11 后未观察到明显的不良反应［14］，表明该探针具有一定的安全性和良好的耐受性。然而，该探针肝脏和肠道的摄取较高，导致腹部具有高背景信号，并且在治疗过程中可能受肿瘤组织坏死、对治疗反应的异质性、Caspase-3 表达低等因素影响，导致对探针的摄取减少［15］，但该探针在无创显像方面仍具有巨大潜力。

2.2 ［123/125I］-FITI 有研究对ICMT-11 的结构进行优化，在三唑环上引入一个碘取代基团，开发了ICMT-11 的5-碘-1，2，3-三唑衍生物FITI。在成功合成探针前体FITI 后，使用邻菲罗啉作为螯合剂成功标记获得［123/125I］-FITI。［123/125I］-FITI 通过引入高极性物质1，2，3-三唑类化合物，使N-烷基化取代基与Caspase-3的S1结构域发生相互作用，提高了探针与Caspase-3的亲和力，从而达到更好的显像效果［16］。

［123/125I］-FITI 的抑制常数Ki 为（6.1±0.9） nM，略低于ICMT-11［（12.4±4.7） nM］，表明该探针与底物结合较紧密，对Caspase-3的亲和力较高。随后有研究选用人结肠癌细胞SW1222 构建了荷瘤小鼠模型，给予依托泊苷诱导细胞凋亡并通过SPECT/CT显像进行体内研究发现，注射依托泊苷的荷瘤小鼠肿瘤组织对［123/125I］-FITI 的摄取有所提高；但与［18F］ICMT-11类似，该探针在腹部摄取较高，而在肿瘤组织总摄取较低，体内降解和代谢较快，SPECT/CT显像效果并不理想［17］。因此，提高肿瘤组织摄取和降低代谢速率是提高Caspase-3 抑制剂类分子影像探针显像的关键。

3 Caspase-3多肽底物类分子影像探针在肿瘤细胞凋亡监测中的应用

Caspase-3 多肽底物类分子影像探针是基于Caspase-3 可识别四肽底物DEVD 设计的，将其与相应的显像和修饰基团相连，能够增强此类探针对Caspase-3 的靶向性和特异性，从而增强显像效果［18］。此类探针进入凋亡细胞后，Caspase-3 特异性识别并切割底物序列，随后剪切产物释放显像信号。相较于Caspase-3 抑制剂类分子影像探针，Caspase-3 多肽底物类分子影像探针不易受治疗早期肿瘤细胞中低表达的Caspase-3影响，能够更好地显示细胞凋亡进程，进而指导治疗效果的早期评估。

3.1 Ac-Tat-DEVD-CV Ac-Tat-DEVD-CV 是由Caspase-3 底物DEVD、细胞穿透肽及荧光基团甲酚紫组成的近红外荧光分子探针。该探针在细胞穿透肽协助下进入肿瘤细胞后，肽-甲酚紫共轭结构在582 nm 处显示发射峰，经Caspase-3 裂解多肽底物后，迅速释放肽-甲酚紫共轭结构，导致582 nm 处荧光强度降低、628 nm 处荧光强度增加，从而增强可探测的荧光强度［19］。将该探针与其他内源性物质（如生物小分子、蛋白质）孵育一定时间后，不会导致荧光比率增加，表明该探针对Caspase-3具有选择特异性。在使用星形孢菌素诱导宫颈癌HeLa 细胞凋亡后，通过Ac-Tat-DEVD-CV进行细胞显像及光谱分析发现，经星形孢菌素处理的HeLa细胞在628 nm处出现了新的发射峰；虽然在复杂的细胞环境中，HeLa 细胞在582、628 nm 处的荧光强度均降低，但其荧光比率仍有所提升；随着共孵育时间延长，HeLa 细胞中Caspase-3 表达和荧光比率均逐渐升高，当加入Caspase-3 抑制剂后则明显降低［19］，二者呈现良好的相关性。因此，Ac-Tat-DEVD-CV在指示细胞凋亡程度方面展现出了优越的性能，有望在小鼠体内进一步进行显像研究。

3.2 Bio-DEVD-HCy 靶向Caspase-3 的小分子荧光/光声（FL/PA）双模态探针Bio-DEVD-HCy，能够将荧光显像的高灵敏度与光声显像的高空间分辨率及高穿透性相结合，从而提供更全面的凋亡显像信息。Bio-DEVD-HCy由靶向肿瘤的生物素、Caspase-3识别底物DEVD 及半花菁染料HCy组成。该探针可与肿瘤凋亡细胞表面高度表达的生物素受体结合，进入细胞后浓聚，被Caspase-3 识别剪切后，生成带有游离氨基的HCy，进而发出强烈的FL/PA 信号。该探针在Caspase-3 工作缓冲液中孵育后，FL/PA 信号强度随着Caspase-3浓度增加呈线性升高，具有较高的动力学参数，并且不易被体内物质干扰，对Caspase-3具有良好的选择性。有研究在4T1荷瘤小鼠尾静脉注射阿霉素（Dox），随后注射Bio-DEVD-HCy进行显像，结果发现，FL/PA 信号强度在注射4 h 后达到最大值，加入生物素阻断剂后，FL/PA信号强度有所降低［20］。因此，Bio-DEVD-HCy 可通过靶向生物素更好地进入肿瘤凋亡细胞并浓聚，从而放大FL/PA 信号，可视化肿瘤细胞中Caspase-3 表达，有望在临床上转化应用。

3.3 ［18F］-CP18 靶向Caspase-3 的PET 显像探针［18F］-CP18 由三部分组成，即多肽底物DEVD、用于增强肾清除能力的半乳糖基团以及用于促进细胞摄取及改善药代动力学的C 末端聚乙二醇链，并通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应进行放射性核素18F 标记。当探针进入肿瘤细胞后被活化的Caspase-3裂解，聚乙二醇链断裂导致其余分子的亲水性降低，从而在细胞中浓聚，继而增加信号强度［21］。该探针与21 种蛋白酶共孵育后，只有Caspase-3 能够使其显著裂解，表明该探针对Caspase-3具有靶向特异性。通过不同肿瘤细胞系荷瘤小鼠体内显像研究发现，经5-氟尿嘧啶或地塞米松治疗后，荷瘤小鼠的肿瘤组织对［18F］-CP18 均能显著摄取［22］。RAPIC等［23］研究发现，结直肠癌细胞荷瘤小鼠在经5-氟尿嘧啶或伊立替康治疗后，［18F］-CP18 在肿瘤部位的摄取略有升高，两者联合治疗后肿瘤细胞Caspase-3表达上调，在肿瘤部位则显示出更高的摄取。此外，［18F］-CP18 主要通过肾脏清除，代谢较快，肿瘤背景较低。这些研究表明，［18F］-CP18 在肿瘤治疗效果监测方面具有较高的应用价值。然而，［18F］-CP18在体内血液循环时间较短，组织代谢快且易受背景干扰，无法得到持久且清晰的显像信息。

3.4 ［18F］-C-SNAT及［18F］SF-DEVD ［18F］-C-SNAT是基于CBT-Cys 的点击缩合反应，通过两步法进行18F 放射性标记，得到的新型智能自组装PET 分子探针。［18F］-C-SNAT 在进入肿瘤凋亡细胞后，多肽底物DEVD 被Caspase-3 识别并剪切，而在肿瘤微环境中存在的谷胱甘肽可将二硫键还原为巯基，随后通过CBT-Cys 的点击缩合反应进行分子内环化，环状探针通过疏水相互作用形成纳米颗粒，在肿瘤细胞中浓聚，从而延长滞留时间［24］。有研究在经Dox 治疗的宫颈癌HeLa 细胞荷瘤小鼠体内PET 显像研究中发现，［18F］-C-SNAT 能够清晰显像发生细胞凋亡的肿瘤部位，并且具有较高的肿瘤背景比。此外，［18F］-C-SNAT 在经抗肿瘤治疗的肿瘤组织积累量显著增加，但耗散速率改变并不明显。有研究对CBT-Cys 的点击缩合反应中芳香腈与氨基硫醇构效关系分析发现，芳香环上的电子离域、吸电子基团、杂原子以及氨基硫醇的亲核性对点击缩合反应均有显著影响［25］，这为该点击缩合反应的优化提供了思路。然而，体内高浓度内源性游离半胱氨酸易与CBT 结构中的巯基竞争性结合，从而影响该点击缩合反应。

自组装PET分子探针［18F］SF-DEVD是将CBT-Cys的点击缩合反应中的环支架进行改进，引入了两个长度适当的苄基以调节配体的长度和芳香性，形成了一个新的生物正交反应支架SF，在改善反应动力学的同时，使其更易发生分子内环化，从而提高在体内的原位自组装效率，达到更理想的显像效果［26］。有研究在宫颈癌HeLa 细胞荷瘤小鼠瘤内注射Dox，评估了［18F］SF-DEVD 的PET 显像能力，结果发现，注射显像60 min 后，该探针在荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡部位逐渐浓聚，PET显像非常清晰；共注射冷化合物［19F］SF-DEVD 后，在肿瘤细胞凋亡部位显示出更高的摄取和更强、更持久的放射性信号［27-28］。结果表明，［18F］SF-DEVD 可用于无创、实时、灵敏地监测体内Caspase-3活性，未来有望应用于临床研究。

3.5 ［18F］-IR780-1 将双模态探针与原位自组装策略相结合，设计并合成了小分子PA/PET 探针［18F］-IR780-1。［18F］-IR780-1 以三唑IR-780 为支架，引入了CHQ，Caspase-3 可切割底物DEVD，二硫键保护的D-Cys 以及用于18F 标记的三氟硼酸盐。［18F］-IR780-1 在肿瘤细胞内部浓聚形成纳米颗粒，增强PET 显像信号的同时，引起聚集荧光淬灭效应，导致FL 信号减弱、PA 信号增强。因此，该探针通过PA和PET联合显像，具有PA显像的高分辨率和PET显像的高灵敏度优点，能够对治疗期间肿瘤组织中Caspase-3 活性进行全面、准确的显像分析。与其他Caspase-3分子影像探针相比，［18F］-IR780-1具有更高的动力学参数，并且只有Caspase-3能够激活其PA信号，表明该探针对Caspase-3具有更高的灵敏度和选择性。体外实验证实，该探针在复杂的生物相关环境中表现出良好的稳定性，可用于后续小鼠体内显像。有研究经Dox 治疗建立脑胶质瘤U87MG 荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡模型，使用［18F］-IR780-1 进行双模态显像，结果发现，经Dox治疗后荷瘤小鼠肿瘤部位对［18F］-IR780-1 具有更高的摄取，产生更强的PA 和PET 信号；当静脉注射Caspase-3 抑制剂Z-VAD-FMK后，PA和PET信号显著降低，表明两者信号的增强主要是因为肿瘤细胞中Caspase-3 表达上调［29］。因此，［18F］-IR780-1 可通过放大PA 和PET 信号，显像细胞凋亡，提供肿瘤组织Caspase-3活性和分布情况，对早期监测肿瘤治疗应答具有重要意义。此外，该探针主要通过肾脏和肝脏清除，并且经Dox治疗后PET信号明显增强［30］，推测可能与Dox的毒副作用有关。因此，［18F］-IR780-1 还可用于监测药物对器官的毒副作用。

综上所述，分子影像是一种新兴的无创显像技术，能够可视化单个分子或特定细胞亚群，从而反映活体状态下分子水平变化。Caspase-3 是细胞凋亡的半胱天冬酶级联反应过程中至关重要的死亡执行蛋白酶，能够启动细胞内蛋白的特异性降解，从而诱导细胞凋亡。设计靶向Caspase-3的分子影像探针，能够实时监测治疗过程中肿瘤部位Caspase-3表达，精准评估治疗效果，从而为个体化治疗提供可靠依据。根据与Caspase-3不同的作用方式，Caspase-3分子影像探针主要分为Caspase-3抑制剂类和Caspase-3多肽底物类分子影像探针。这两类探针对Caspase-3均具有良好的靶向特异性和选择性，已成功应用于实时显像小鼠或人体治疗早期的肿瘤细胞凋亡。但这些探针仍有一定不足，如灵敏度低、组织背景高、代谢速度快等，尚需进一步优化。