李春雨，赵卓君，白万乔，高楼军

（延安大学 化学与化工学院，陕西省化学反应工程重点实验室，陕西 延安 716000）

盐酸四环素（TET）作为一种抗生素因吸收效果好、价格低廉、广谱活性而被广泛应用于养殖业中动物疾病的预防和治疗［1-3］。但盐酸四环素使用不当时会导致其残留通过食物链传播，并在人体中累积，对人体产生危害，如耐药性、过敏反应、胃肠道疾病、肾脏和肝脏损害等［4-6］。

目前，已报道的盐酸四环素的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）［7］、毛细管电泳法（CE）［8］、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）［9］、化学发光法［10］、电化学分析法［11］等，但这些技术大多需要昂贵的设备、专业的操作人员，且耗时较长。而荧光分析方法具有操作简单、灵敏度高、响应快等优点，可用于猪肉中四环素的检测。生物质碳量子点（CDs）是一种新型的碳纳米材料，因制备方法简单、细胞毒性低、生物相容性高、光稳定性良好而受到广泛关注，主要应用在荧光探针、生物成像、光催化和光电器等领域［12-14］。目前已有许多以生物质材料为碳源成功合成的生物质碳量子点报道，如使用香蕉［15］、牛奶［16］、枸杞［17］等制备碳量子点。另外，由于四环素含有β-二酮酸盐构型，可以作为一种很好的配体通过“天线效应”螯合铕离子（Eu3+）后发射出特征荧光［18］，铕基荧光探针已成为四环素检测的焦点。

本研究以橙皮为原料制备了碳量子点，并与Eu3+共同作为荧光基团，构建双发射比率型荧光探针（Eu3+-CDs），用于抗生素盐酸四环素的检测（图1）。随着TET 浓度的增加，一方面由于“内滤效应”，所制备的生物质CDs 在425 nm 处的荧光逐渐被TET 猝灭；另一方面，TET 与Eu3+螯合形成配合物，使得617 nm 处的荧光逐渐增强。其荧光强度比（IF617/IF425）与TET 的浓度直接相关。所构建的比率型荧光探针Eu3+-CDs 不但可以减少光源不稳定等因素带来的检测误差，还可以显著提高分析方法的准确度［19］，有望用于肉类中盐酸四环素的高灵敏测定。

图1 Eu3+-CDs荧光探针的构建及其用于盐酸四环素检测的示意图Fig.1 Schematic diagram of the fabrication of Eu3+-CDs fluorescence probe and its application for the detection of tetracycline hydrochloride

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与样品

F-7000 荧光分光光度计（日本日立有限公司）；UV3600PLUS220/230VC 紫外可见分光光度计（日本岛津有限公司）；Nicolet iS20 傅里叶变换红外光谱仪、K-Alpha X 射线光电子能谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；DHG-9145AF电热恒温鼓风干燥箱（上海和呈仪器制造有限公司）。

Eu（NO3）3·6H2O、盐酸四环素、十二烷基磺酸钠、三氯乙酸、阿奇霉素、红霉素、氟苯尼考、阿莫西林、硫酸新霉素、硫酸卡那霉素、氨苄西林、硫酸链霉素、头孢曲松钠、组氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、乳糖和半乳糖等均购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。以上药品均为分析纯。橙子、猪肉购自本地超市。

1.2 实验方法

1.2.1 生物质碳量子点的制备将橙皮在60 ℃下烘干后，研磨成粉末。准确称取0.04 g 橙皮粉末，分散在25 mL 超纯水中。随后将混合物转入50 mL 聚四氟乙烯反应釜内，190 ℃下反应4 h。待自然冷却至室温后，用0.45 µm 的针头过滤器过滤产物，得到的黄色溶液即为橙皮CDs 的分散水溶液。将其置于4 ℃保存，备用。

1.2.2 荧光探针的构建配制0.01 mol/L 的Eu（NO3）3·6H2O 溶液和1×10-4mol/L的十二烷基磺酸钠溶液。将5 mL 0.01 mol/L 的Eu（NO3）3·6H2O 溶液与0.6 mL1×10-4mol/L 的十二烷基磺酸钠溶液混合均匀，制备Eu3+溶液。取300 µL 稀释16 倍的CDs 溶液与70 µL Eu3+溶液于比色皿中，摇匀后再加入50 µL pH 5.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，即得到Eu3+-CDs荧光探针溶液。

1.2.3 Eu3+-CDs荧光探针对TET的检测向420 µL荧光探针溶液中加入不同浓度的盐酸四环素，用去离子水定容至1 mL，并于室温下振荡1 min。用荧光分光光度计测定并记录617 nm 与425 nm 处的荧光强度IF617与IF425，计算两者的比值IF617/IF425。测定条件：激发波长为370 nm，检测波长范围为390～680 nm，光电倍增管电压为700V，发射和激发的狭缝宽度为5 nm。

2 结果与讨论

2.1 CDs的表征

通过透射电镜（TEM）对制得的CDs 进行表征。如图2A 所示，CDs 呈准球形，且分散良好，平均粒径为（4.04±0.22） nm。CDs 的高分辨率TEM（图2A 插图）呈现出高度平行和有序的晶格条纹，面间距为0.21 nm，证明制得的CDs 具有良好的结晶性［20］。使用傅里叶红外光谱（FT-IR）对CDs 的表面官能团进行表征，如图2B 所示，在3352 cm-1和3 365 cm-1处的谱带和峰分别归属于O—H 和N—H 的伸缩振动［21］，处于1540～1730 cm-1范围的谱带归属于C=O和C=C的伸缩振动［22］。

图2 CDs的TEM图（A）和 红外光谱图（B）Fig.2 TEM image（A） and FT-IR spectrum（B） of CDs insert A：enlarged TEM image

采用X 射线光电子能谱（XPS）对CDs 的元素含量进行分析。如图3A 所示，制备的CDs 主要包含C（65.37%）、N（2.53%）和O（32.10%）3 种元素。在CDs 的C1s 谱图（图3B）上，有3 个结合能分别为288.4、286.3、284.7 eV的主峰，说明CDs表面存在C—C/C=C、C—O、C=O/C=N等基团。N1s谱图（图3C）位于399.71 eV 的主峰说明了C—N 等基团的存在。O1s 光谱（图3D）位于532.52 eV 的主峰，表明所制备的CDs表面存在 C=O等基团［23］。XPS结果和FT-IR数据基本吻合，表明合成的CDs表面富含氨基、羟基、羧基等亲水基团，因此在水溶液中分散性良好。

图3 CDs的XPS的全谱图（A）以及高分辨C1s谱图（B），高分辨N1s谱图（C），高分辨O1s谱图（D）Fig.3 The XPS survey spectrum（A） and high-resolution C1s spectrum（B），high-resolution N1s spectrum（C），high-resolution O1s spectrum（D） of synthesized CDs

2.2 CDs的光学性质

采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱考察CDs的光学性能，如图4所示，CDs在紫外吸收区呈现出明显的吸收，可归因于C=C的π-π*跃迁［24］。当激发波长为370 nm时，CDs的最大发射峰位于425 nm处。

图4 CDs的紫外-可见吸收光谱（Abs）、荧光激发（Ex）和荧光发射光谱（Em）Fig.4 UV-Vis absorption（Abs），fluorescence excitation（Ex） and emission（Em） spectra of CDs

2.3 Eu3+-CDs探针制备条件的优化

为提高CDs 荧光探针的灵敏度，对Eu3+的浓度、pH 值和反应时间等实验条件进行了优化，探究了在不同Eu3+浓度（10～100 µmol/L）、不同pH 值（pH 2.0～6.0）、不同反应时间（15～300 s）条件下制备的Eu3+-CDs 探针的荧光性能。结果显示，IF617/IF425分别在Eu3+溶液浓度70 µmol/L、pH 5.8 时达到最大值（图5A～B），说明该条件下探针的荧光性能最好，因此后续选择在该条件下进行实验。反应进行90 s时，荧光强度趋于稳定（图5C），此时反应达到平衡。因此确定90 s为最佳反应时间。

图5 Eu3+浓度（A）、pH值（B）、反应时间（C）对探针荧光强度的影响Fig.5 Effect of Eu3+ concentration（A），pH valve（B） and reaction time（C） on probe fluorescence intensity

2.4 Eu3+-CDs荧光探针对盐酸四环素的选择性

在优化实验条件下，以阿奇霉素（AZM）、红霉素（EM）、氟苯尼考（FF）、阿莫西林（AML）、硫酸新霉素（NEO）、硫酸卡那霉素（KM）、氨苄西林（AMP）、硫酸链霉素（STR）、头孢曲松钠（CTR）、组氨酸（His）、丝氨酸（Ser）、半胱氨酸（Cys）、天冬氨酸（Asp）、赖氨酸（Lys）、苯丙氨酸（Phe）、葡萄糖（Glu）、乳糖（Lac）和半乳糖（Gal）等抗生素以及常见的阳离子（Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Ni2+、Mn2+、Hg2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Cr3+、Al3+）和阴离子（Cl-、SO2-4、Ac-、NO-3、CO2-3）为干扰离子，各抗生素及干扰离子的浓度均为100 µmol/L，考察了Eu3+-CDs 荧光探针对盐酸四环素的选择性。如图6 所示，Eu3+-CDs荧光探针仅对盐酸四环素产生比较显著的荧光强度比信号，表现出优异的选择性。

图6 不同抗生素、阴阳离子对Eu3+-CDs荧光强度的影响Fig.6 Effects of different anions and cations on fluorescence intensity of Eu3+-CDs

2.5 Eu3+-CDs荧光探针对盐酸四环素的荧光检测性能

随着盐酸四环素浓度的升高，425 nm 处CDs 的荧光逐渐减弱，而由于越来越多的盐酸四环素与Eu3+螯合形成配合物，使得617 nm 处的荧光逐渐增强（图7A）。在盐酸四环素浓度（c，µmol/L）10～100µmol/L 范围内，IF617/IF425与盐酸四环素浓度呈现良好的线性关系，线性方程为IF617/IF425=0.01561c（µmol/L） +0.05081（图7B），相关系数r2=0.9926。根据3δ/S（δ为7次空白样品检测结果的标准偏差，S为线性方程的斜率）计算，得到方法的检出限为5.09 µmol/L。

图7 不同浓度盐酸四环素的荧光强度（A） 和荧光强度比（IF617/IF425）与盐酸四环素浓度的线性拟合结果（B）Fig.7 Fluorescence intensity for various concentrations of TET（A） and fitting curve of IF617/IF425 vs. TET concentration（B）

将本方法与已有的测定TET 的方法进行对比，如表1 所示。结果表明，本文所构建的荧光探针在检测TET时具有较宽的线性范围及较低的检出限，检测性能良好。

表1 不同TET检测方法的比较Table 1 Comparison of different methods for detection of TET

2.6 可能的机理探究

考察了Eu3+、Eu3+-TET 和TET 的紫外可见吸收光谱。由图8A 可见，与Eu3+配位后，TET 位于273 nm 和358 nm 处的吸收峰消失，在305 nm 和399 nm 处出现了新的吸收峰，表明Eu3+与TET 发生相互作用，生成了新物质［30］，且该物质随着TET浓度的增加而增加。因此，在617 nm 处出现的荧光峰强度随着TET浓度的增加而增加。

图8 Eu3+、Eu3+-TET和TET的紫外可见吸收光谱（A），Eu3+- TET的紫外可见吸收光谱和CDs的激发光谱（B），CDs和 Eu3+-CDs-TET的荧光寿命曲线（C）Fig.8 UV-Vis absorption spectra of Eu3+，Eu3+- TET and TET（A），UV-Vis absorption spectra of Eu3+- TET and fluorescence excitation spectra of CDs（B），fluorescence lifetime curves of CDs and Eu3+-CDs-TET（C）

从Eu3+-TET 的紫外可见吸收光谱和CDs 的荧光激发光谱（图8B）图可观察到，两者存在部分重叠，荧光猝灭现象符合“内滤效应”［31-32］。另外，测定了CDs及添加70 µmol/L 盐酸四环素后Eu3+-CDs溶液的荧光寿命，其荧光衰减曲线如图8C 所示。荧光寿命测定结果（表2）显示，Eu3+-CDs 探针与TET 结合前后的荧光寿命分别为2.84 ns和2.33 ns，变化不大，推测TET对CDs的荧光猝灭效应可能由静态猝灭导致［33］。因此，TET 对CDs 的猝灭是内滤效应和静态猝灭协同作用的结果，导致425 nm 处的荧光峰强度随着TET浓度的增加而降低。

表2 Eu3+-CDs和Eu3+-CDs-TET的荧光寿命结果Table 2 Fluorescence lifetime result of Eu3+-CDs and Eu3+-CDs-TET

2.7 猪肉中盐酸四环素的测定

为了验证方法的实用性，对空白猪肉样品分别进行10.00、30.00、50.00 µmol/L 3 个水平的加标回收实验，每个样品平行测定3 次，结果如表3 所示。所得加标回收率为102%～110% ，相对标准偏差（RSD）为0.20%～2.4%。结果表明该方法用于肉类中盐酸四环素的检测具有很好的实用性。

表3 猪肉样品中盐酸四环素的加标回收率和相对标准偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of TET in spiked pork samples

3 结 论

以橙皮为原料制备的碳量子点和铕离子为荧光基团，构建了双发射比率型荧光探针（Eu3+-CDs）对盐酸四环素含量进行检测。在10～100 µmol/L浓度范围内，盐酸四环素的检出限为5.09 µmol/L。该方法成功用于猪肉中盐酸四环素含量的检测，加标回收率为102%～110%，相对标准偏差小于3.0%。该方法具有灵敏度高、选择性强、制备方法简单、绿色环保、便于推广等优点，在肉类抗生素的检测方面具有较大潜力。