王彦林

中国福利会国际和平妇幼保健院产前诊断中心（上海 200030）

近10 余年，伴随医学技术的快速进步，尤其是医学遗传学技术与宫内操作技术的飞跃式发展，一批新技术应用于围产医学临床，改变了产前诊断与胎儿医学的面貌。胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）、无创产前检测（noninvasive prenatal testing，NIPT）、染色体微阵列（chromosomal micro-array，CMA）、外显组测序（exome sequencing，ES）等遗传学技术的临床应用，高分辨影像学技术在胎儿疾病诊断中的应用，胎儿宫内治疗技术以及产房外科治疗（ex-utero intrapartum treatment，EXIT）技术日新月异，将既往的纵向学科链胎儿-新生儿-儿科理念推向整合，宫内儿科学应运而生[1]。围产医疗的重心不断向母胎双重关注方向转移。

NIPT 是过去10 余年里产前诊断领域的重大突破。NIPT 大幅提升了唐氏综合征产前筛查的灵敏度和特异度，在临床得到广泛应用。低深度基因组测序技术的特点赋予了NIPT 唐氏综合征筛查以外的更多潜力，但是也给结果解读和临床处理带来了极大的复杂性。一方面，NIPT 在未来必将应用于更为广泛的领域；另一方面，临床上关于NIPT 的许多应用存在许多相对模糊的区域。NIPT 依然面临许多实际问题和困惑，需要更多循证医学证据加以厘清，以导向更为科学的临床实践。

1 高龄及合并多种高危因素双胎妊娠的NIPT选择

NIPT 目前已作为低危双胎人群非整倍体一线筛查方案[2]。然而迄今为止，对于什么是双胎妊娠的“高龄”及“高危人群”则并无界定。通常对于单胎，基于非整倍体发生风险，将分娩时≥35 岁定义为高龄人群，而对于双胎，既往将32 岁作为高龄的界限[3]。NIPT 的出现模糊了“高龄”作为产前诊断指征的界限，而基于辅助生育技术的二代、三代试管双胎，以及“高龄”双胎，虽然一直是业界共识需要后续进行产前诊断的人群，但是这些人群也是最希望规避侵入性操作风险的孕妇。虽然羊水CMA 和ES 能够获得比NIPT 更多信息，但是产前诊断也必须考虑风险的必要性。对于“高危”或者“高龄”孕妇，CMA 与ES 相比NIPT 所能获得边际效应需要充分的临床研究证据，以评价这部分孕妇承受侵入性检测风险接受产前诊断是否确实有益。

2 双胎之一早期消失的NIPT最佳时机

辅助生殖技术是双胎的重要来源之一。伴随辅助生殖技术的推广，双胎之一早期消失发生率达到了15%～30%[4]，成为NIPT假阳性、假阴性以及重抽血率增加的重要因素之一。这一情况临床常见，因此诸多研究团队都在试图攻克这一难题。然而，当前没有足够的数据来全面评估消失双胎NIPT的表现。通常的临床共识是一胎消失后8周进行NIPT检测。笔者与张静澜博士团队[5]之前针对不同孕周不同绒毛膜性减胎人群的研究发现，通过胎儿特异性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的数量和等位基因分数不但可以检测卵子捐赠、污染和双胞胎完整的葡萄胎等复杂妊娠，同时发现约80%(7/9)未发育双胎的游离DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）在减胎7周后下降，而67%(6/9)的幸存胎儿cffDNA 在减胎2 天内立即增加。8 周是否是合适的双胎之一消失后的NIPT检测时间，是否需要等待更长时间以提高NIPT检测的准确性，尚缺乏足够的证据。

3 NIPT异常结果对妊娠合并恶性肿瘤的提示作用

外周血游离DNA 不但包括来自胎儿的DNA，也可能包括来自恶性肿瘤细胞的DNA。因此，在妊娠患者基于NIPT的胎儿风险评估中，也可以检测到源自母体肿瘤的DNA 序列。多条染色体非整倍体（multiple chromosome aneuploidies，MCAs）是NIPT检测失败或者结果异常的最常见原因之一，也是提示隐匿性母体恶性肿瘤最常报告的NIPT异常。2015年，Bianchi等[6]总结了125 426例NIPT检测队列，其中共报道了39例MCAs结果，发生概率为万分之3。其中7例确诊为妊娠合并恶性肿瘤。国内学者针对193万例NIPT检测的回顾性研究中共发现639例MCAs的孕妇，其发生比例与Bianchi团队报道一致，并从中诊断了41例妊娠合并恶性肿瘤患者[7]。

现有研究已经证实，NIPT检测发现的MCAs与妊娠合并恶性肿瘤存在相关性。当NIPT成为针对唐氏综合征的一线筛查方法之后，势必需要更有效的方法对孕妇是否合并恶性肿瘤进行评估。上述国内学者的研究分析了所有MCAs孕妇的CNV数据，以CNV区域在整个基因组中的占比（fraction of CNV，FCNV）为标志物对MCAs孕妇罹患恶性肿瘤的风险进行分级，结果发现FCNV 对MCAs 孕妇的恶性肿瘤阳性预测值可以达到30%；如进一步结合血浆生化肿瘤标志物后，阳性预测值可达到75%。但是，这一模型在临床实际应用的效果究竟如何尚无评价数据。NIPT检测到的恶性肿瘤中构成比较高的是淋巴瘤、乳腺癌和消化道肿瘤，超声、磁共振成像和内镜等影像学技术在后续诊断中的作用非常重要。但是，目前对这类孕妇的临床综合评价尚无可参考的规范，也缺乏系统的评估体系。其中尤为重要的是，当报告孕妇存在合并恶性肿瘤高风险后，将对其带来极大的心理压力，使之产生焦虑、抑郁等情绪，影响母婴安全。在缺乏系统性评价体系的情况下，报告此类风险，将带来很大的伦理问题。

4 性染色体异常的伦理思考

虽然NIPT 的目标疾病是唐氏综合征、18-三体综合征和13-三体综合征，但是性染色体异常从一开始就以附加报告的形式出现。性染色体异常种类多，并且嵌合的发生率高，其在染色体非整倍体中构成比最高。但是与唐氏综合征等疾病不同，性染色体异常大多并不属于严重致残致畸的疾病。Turner综合征和Klinefelter综合征以影响生育为主要表现，而47,XXX综合征则可能不产生任何临床可见的表型。此外，性染色体异常由于存在嵌合、X染色体失活等因素，其表型变异多，异质性很大。

产前诊断往往以终止严重发育异常胎儿的妊娠为最终目的，出于伦理考量，对于性染色体异常的NIPT结果是否报告存在较多争议。许多国家并不将性染色体列入NIPT筛查范围。欧洲人类遗传学会和美国人类遗传学会联合声明，反对NIPT对性染色体进行筛查[8]。国际产前诊断学会、澳大利亚和新西兰皇家妇产科学院声明，性染色体筛查需在知情同意下有选择的进行。

不可否认的现状是，在我们现有NIPT阳性报告中，诊室的空间及时间资源有将近一半被这一类报告占据。因此，我们所面对的问题并非是否报道性染色体异常结果（在目前的现实情况下讨论这一问题是不切实际的），而是怎样在遗传咨询的过程中提供科学的决策依据。以宫内儿科学的理念处理这一问题，需要咨询医师在面对孕妇的同时，也为尚未出生的胎儿负责。实际上，在真实世界中只有25%的Klinefelter综合征患者因一系列问题就诊[9]，这是否意味着许多性染色体异常的胎儿出生后并不会面临实际的问题？通过显微外科和辅助生育等手段，一些Klinefelter 综合征的患者也能获得生育能力。因此对于这类患者，亟需大样本的纵向研究或横断面研究回答在现代医疗技术介入的情况下，他们在性功能、生育、学业、就业等方面的真实情况，而非笼统地以“不能生育”进行总结。这些都是正确处理性染色体异常的NIPT 结果、提供科学遗传咨询意见、进行充分知情选择的必备功课。

5 单基因疾病无创产前筛查真正应用于临床的困境

虽然NIPT 从唐氏综合征扩展到包括基因组拷贝数变异（copy number variations，CNVs）等一系列异常，但是其所针对的依然是染色体结构异常和微缺失、微重复综合征。由于NIPT 低深度NGS 的特点以及cffDNA 在孕妇外周血中的低浓度，传统的NIPT 技术难以对胎儿单基因疾病进行筛查。针对胎儿单基因遗传病的无创检测目前主要遵循两种策略。

一种是针对胎儿与母亲的差异序列进行检测，即胎儿的基因变异为新发变异，或者为遗传自父亲的变异。这一情况下由于排除了母亲同源序列的位点干扰，适当加深测序深度，采用针对性的数据解读程序，就能对胎儿是否携带某个变异位点进行检测。2011年英国国家医疗体系（UK National Health Service,NHS）首次批准NIPT用于胎儿性别确定以及Rh阴性孕妇胎儿Rh血型的临床鉴定[10-14]。2012年NHS批准NIPT用于FGFR3基因变异导致的软骨发育不全和致死性发育不良[15]。2014年，NHS批准基于NGS的NIPT技术进行多个基因的父源或显性新发变异检测[16]。贝勒医学院于2021年发表一项基于NGS技术、包含25种显性单基因病、30个基因检测的前瞻性研究，共纳入2 208名孕妇，结果显示阳性率高达5.7%，在有随访结局的65 例中没有发现假阳性和假阴性案例[17]。2022年复旦大学附属妇产科医院徐晨明教授团队采用协调等位基因感知靶标富集测序（coordinative allele-aware target enrichment sequencing，COATE-seq）同时进行拷贝数变异和显性单基因病检测，在入组的1 129名孕妇中，检测到54例胎儿非整倍体、8例微缺失/微重复和8例单基因变异，灵敏度为100%，特异度为99.3%[18]。

去年11月，新英格兰医学杂志同期发表了两篇通讯[19-20]，分别介绍了采用深度家系外显组测序和高分辨率无创胎儿外显组筛查的方法，深度家系外显组测序能够在完成携带者筛查的同时，准确检出胎儿与母亲的差异位点，而高分辨外显组筛查方法也可以实现对各胎龄胎儿新发变异的准确检出。

不同于差异性序列分析，对于母亲携带相同致病变异的胎儿（如常染色体隐性遗传病或者X 连锁隐性遗传病），由于检测分辨率的问题，目前无法通过直接测量方法对胎儿的基因型做出判断。基于剂量失衡计算胎儿的单倍型是主要的技术手段。剂量失衡计算方法主要包括相对变异剂量（relative mutation dosage，RMD）计算和相对单倍型剂量（relative haplotype dosage，RHDO）计算两种。RHDO在多种疾病的无创产前诊断中被报道，但是这种方法需要先证者的样本来确定父母的单倍型，因此仅限于再发预防。然而，有先证者的家庭一般倾向于高估风险，更愿意选择产前诊断。目前很多研究的目标是开发无先证者的 RHDO，长度长测序等技术可能在此领域产生突破。此外，增加胎儿DNA 浓度结合靶向测序的方法，也可能是另一条路径。前述高分辨率无创胎儿外显组筛查的研究显示，在cffDNA占比超过20%时，可以检测出胎儿是否携带母系遗传的变异。

6 非cffDNA来源的NIPT新方法临床应用的潜力

临床目前采用的NIPT 基于cffDNA 的低深度NGS，不区分来自胎儿的DNA与来自母亲的DNA，因此有其方法学上的局限。有学者在探索采用其他来源的胎儿遗传物质，实现类似基于cffDNA 的NIPT功能，并且获得cffDNA所不包含的信息。其中，基于细胞的无创产前检测（cell-based NIPT,cbNIPT）是研究较多的一种方法。在妊娠期间需要常规进行宫颈细胞筛查。宫颈细胞检查时采集宫颈黏液，可以采用特殊的方式富集出高纯度的滋养层细胞（trophoblast retrieval and isolation from the cervix,TRIC）。TRIC 来自于胎盘，对于胎儿基因组有高度代表性。有研究发现，通过TRIC，早在妊娠5周即可检测常见的三体，还可检测三倍体、缺失、重复、不平衡结构重排、镶嵌、罕见常染色体三体性、局限性胎盘嵌合体(confined placental mosaicism，CPM)及单基因疾病等[21]。与cffDNA不同，基于TRIC的检测还能获得与胎盘功能和产科并发症相关的信息。有研究认为，与胎盘形成相关的妊娠晚期并发症会影响TRIC细胞数，从而可能通过TRIC细胞数的变化对妊娠晚期并发症作出预测。由于TRIC获得较为容易，同时拥有cffDNA所不包含的信息，因此有可能成为未来NIPT发展的另一条路径。

7 结语

NIPT 技术的进化和多元化，如增加测序深度、采用外显组测序或目标片段捕获测序方法、利用非cffDNA来源的胎儿信息进行检测等，都将使得NIPT迈进更好的十年。而这只是胎儿医学发展之一斑，近年兴起的宫内儿科学锚定的目标是从筛查诊断为主，发展为筛查、诊治并重。产前诊断不再以终止妊娠为目的，开展合适的治疗和干预措施、改善预后、挽救胎儿成为了与诊断紧密伴随的目标。本刊同期组稿的几篇文章，分别从我国胎儿镜配置和使用的现状、重症胎儿膈疝的宫内治疗、宫内心脏介入手术等多个不同的角度，探讨了胎儿疾病的宫内治疗。未来的围产医学必然更依赖于多学科交叉与协作，而在此过程中更需不断发展新技术，解决临床问题。如同NIPT在过去十年来所取得的成就一般，在新的十年里，以NIPT为代表的筛查技术，与更多前沿宫内治疗技术相结合，将能为医治胎儿带来新的希望和可能。