王美凤，王秀华，李 晨，吕若萱，杨 冰

（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，农业农村部海水养殖病害防治重点实验室，青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室，山东青岛 266071；2.上海海洋大学，上海 201306）

水生环境可作为许多病原中间宿主生存的媒介，并能影响人类和动物健康[1-2]。水生环境下的疫病传播是一个不容忽视的问题，感染病原的水生动物不仅会从食用安全角度危害人类身体健康，也可制约物种的多样性发展，甚至会导致外来物种入侵、生物量减少、稀有物种灭绝等毁灭式影响，破坏生态平衡。从病原传播风险方面进行研究能够有效预防疫病传播。

近些年关于采用环境DNA（environmental DNA，eDNA）方法监测水生动物的研究日趋增多，目前该技术已被广泛应用于鱼类[3]、甲壳类[4]、哺乳类[5]、两栖类[6]以及爬行动物[4，7]、软体动物[8]和浮游生物[9]等多种水生生物研究。

本文从物种多样性调查、生物量评估，以及稀有物种和外来物种入侵监测、种群遗传监测和疫病监测等方面，对水生动物eDNA 研究状况进行概述，同时展望了其与水生动物疫病传播研究相结合的发展前景，以期为eDNA 技术在水生动物疫病监测领域的进一步发展和应用提供新思路和切入点。

1 eDNA 简介

物种与环境相互作用进行物质交换时，会不断地在周围环境中留下DNA 片段。近年来，一种新的生物监测方法eDNA 技术获得了快速发展。eDNA 是指用非直接接触生物的方法，从生态体系的非生命组成部分（沉积物、空气、水体、土壤等）中提取到的总DNA，包括细胞内DNA（即生物体通过尿液、粪便、黏液或皮肤等释放到环境中的遗传物质）和游离DNA（即生物体细胞结构破坏或者细胞死亡裂解而产生的遗传物质）[10-11]。

Rondon 等[12]2000年提出了eDNA 技术的概念。eDNA 技术是指从环境样品中直接提取DNA片段后，利用测序技术对生物进行定性或定量检测分析的方法[8]。直到2008年，法国研究人员Ficetola 等[13]才首次应用eDNA 方法从自然系统水样中确认了水生入侵物种（野生动物）的存在。2010年，Jerde 等[14]在北美地区通过对银鱼和大头亚洲鲤鱼的检测，证明了eDNA 技术作为淡水系统中入侵物种检测工具的有效性。eDNA 还可以提供已灭绝的大型生物群落信息，因其短的DNA序列可以持续保留很长时间，可用于对古老沉积物、永久冻土和冰芯等的研究[15]。

近年来，eDNA 技术得到快速发展，已被广泛应用于群落生态学、古环境、生物监测、生物保护学、入侵生态学等多个研究领域，并在多个生态系统中被成功测试，包括淡水、海洋和河口[10，16]，甚至被应用于国际贸易关口的病原体检测，其对于保障水生动物贸易安全意义重大[17]。

与传统方法相比，eDNA 技术具有较多优点。它是一种新型、有效、无创、快速、经济且易于标准化的方法，其最大优势在于非侵入性取样方式，可以作为一种有效的替代组织或标本的取样方法，对目标物种及周围环境不会造成伤害[18]。借助水环境中悬浮的脱落组织，更便于取样和检测DNA，尤其针对传统工具无法观察到的稀有生物[14]。目前，随着禁渔政策的落实，该技术对于研究水体中的生物尤为重要。对于一些物种（例如两栖动物）来说，传统的调查在特定季节或特定天气条件下非常困难，但不会妨碍eDNA 的取样[19]。eDNA 技术有助于实现更快捷的现场采样，且具备较大的时间和空间灵活度，如早期发现入侵物种[20]，识别群落组成随时间的变化[21]，跟踪鱼类迁徙模式[22]，亦能同时监测水中所有物种[23-24]。eDNA 技术在一定程度上降低了研究成本，减少了研究时间，对监测陆地和水生生态系统中的当代生物多样性具有重大意义[19]。

2 水生动物eDNA研究概况

从1988年至今，全球对于eDNA 的关注一直呈现递增趋势，尤其近8年关注度逐渐增高，在利用eDNA 检测水生生物方面的研究报道迅速增加，主要涉及以下五方面内容。

2.1 物种多样性调查

传统的海洋生物多样性调查多采用拖网调查方式[25]。言柯程等[26]基于2020年南黄海西部eDNA 的采样数据和底拖网调查数据，研究表明eDNA 元编码技术获取的鱼类种数高于底拖网调查。eDNA 元编码技术可以作为传统渔业资源评估的一种新思路，有助于监测海洋生物多样性和空间分布。同时，eDNA 元编码可以通过评估鱼类群落功能的多样性来检测人为因素对鱼类群落的影响，有助于确保在多个地点进行持续性生物多样性监测，有助于生态系统保护和渔业资源可持续利用，实现联合国2030年可持续发展目标中的“目标14”[27]。在物种丰度鉴定方面，eDNA 条形码技术较传统形态学监测更具优势。王晨等[28]2022年通过该技术以秦淮河为研究区域证实了这一点，其探究了秦淮河生物多样性的组成、上下游生物多样性的差异，以及生物多样性与环境因子的关系，为秦淮河的生物多样性保护提供了更多依据。

臧能玮等[25]2022年应用eDNA 技术完善了广东省珠海外伶仃海域国家级海洋牧场示范区的海洋生物多样性研究报告，对于海洋牧场微生物研究极具重要的参考价值。李晓玲等[29]2022年基于eDNA 技术，对东海秋季鱼类的物种多样性进行了研究。郭宁宁等[30]2023年采用eDNA 技术，对赤水河秋季鱼类进行了取样调查，因赤水河流域正处于禁渔期，采用传统调查法可能会对鱼类产生一定程度的损伤，而采用eDNA 技术在不影响鱼类自然繁殖的情况下，可获得赤水河秋季鱼类的分布及物种组成，为探索禁渔政策下更适应禁渔区域的鱼类调查方法开展了先期研究，有助于赤水河生物多样性保护。

2.2 生物量评估

Teruhiko 等[31]2012年探究了一种在水族馆和实验池塘中估算鲤鱼（CyprinuscarpioL.）生物量的eDNA 方法，并利用这种方法估算了一个天然淡水泻湖中鲤鱼的生物量和分布，反映了普通鲤鱼在自然环境中的潜在分布，为制定生态系统保护管理计划提供了信息。研究[32]表明，银鲤鱼（Hypophthalmichthysmolitrix）的数值密度和生物量密度与环境DNA 浓度和检出率呈正、非线性相关，随着银鲤鱼密度的增加，eDNA 浓度和检出率均迅速增加，但在中等密度时趋于稳定。卢珊等[33]在2015年进行了泥鳅（Misgurnusanguillicaudatus）和日本沼虾（Macrobrachiumnipponense）饲养密度与eDNA 丰度的定量分析，利用荧光定量PCR方法进行定量分析发现，无论是泥鳅还是日本沼虾，eDNA 量均随饲养密度的增加而增加，动物密度与其eDNA 之间存在非线性相关关系。此研究为建立起一套淡水生态系统丰富度检测的理论及技术体系提供了相应基础。

为了能够精确掌握中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）在渤海海域的分布与资源量状况，以及合理开发利用其资源，李苗等[34]2019年以渤海中国对虾为研究对象，通过实时荧光定量PCR 检测，建立了一套针对中国对虾的eDNA 技术操作流程，为中国对虾分布监测及其资源评估提供了一种新方法。闫卉果等[35]2021年建立了基于eDNA 的岩原鲤（Procyprisrabaudi）实时荧光定量 PCR（qPCR）检测方法，发现其特异性高、时效性好，可准确鉴别岩原鲤，然后用该方法探讨了eDNA 浓度与其生物量的定量关系，以反映岩原鲤在不同采样点的生物量及时空动态。高天翔等[36]2022年以舟山岛礁水域优势鱼种褐菖鲉（Sebastiscusmarmoratus）为研究对象，建立了褐菖鲉养殖密度与其eDNA浓度之间的相关性，为基于eDNA 技术的褐菖鲉生物量评估奠定了基础。

2.3 稀有物种和外来物种入侵监测

eDNA 技术在低密度下检测物种具有极高的灵敏度，特别针对稀有、隐蔽、濒危和入侵物种的早期识别和监测。Jerde 等[14]在美国芝加哥、伊利诺斯州等地区的运河和水道上划定了两种亚洲鲤鱼的入侵前沿，展示了eDNA 技术作为一种检测工具在淡水环境中的有效性。Rein 等[37]2020年开发并验证了一种基于数字液滴PCR（ddPCR）的eDNA新方法，可用于对多个栖息地化石的精确检测和定量。Blattner 等[38]2021年开发了一种针对具有代表性的淡水大型无脊椎动物物种的靶向生物指标物种eDNA 检测方法，有助于促进高山淡水环境的完整性监测和评估。杨嘉琪等[39]2022年从水体环境中提取eDNA 应用于中华白海豚的分布调查，建立了中华白海豚eDNA检测方法，同时优化检测条件，获得了中华白海豚eDNA 检测的最佳方案，为中华白海豚的野外监测提供了新的数据信息，为近岸海域渔业资源的评估和管理提供了新的参考和切入点。Yongkai 等[40]使用基于eDNA 的方法在肉眼可观察到及未直接观察到江豚的位置均成功检测到其DNA，进一步证实eDNA 技术比传统的目视调查具有更高的灵敏度。

Sepulveda 等[41]2020年提出了eDNA 方法是否可以用于水生入侵物种管理这一问题。徐梦珍等[42]2021年研究了eDNA 技术在贻贝入侵监测中的应用，明晰了eDNA 浓度与贻贝种群规模或密度之间的定量关系，这对贻贝入侵的有效防控和生态系统监测与保护具有重要意义。在北美地区的许多河流中，有多种非本地鲤科鱼类的种群在密西西比河流域被发现，但追踪其入侵很困难。当种群数量较低时，了解入侵前沿的位置对自然资源管理者很有价值，这可以最有效防止未来的生态和经济损害[43]。杨力凤等[44]2022年从入侵物种监测、入侵途径、分布与危害程度以及与其他物种的相互关系等方面，介绍了eDNA 技术在生物入侵研究中的应用进展。韩德科等[45]2022年研究了eDNA 技术在监测草海克氏原螯虾分布应用中的最适条件，为进一步分析克氏原螯虾的引入或扩散初期的监测、预警和应急处理提供了有效依据，保护了生物的多样性。

2.4 种群遗传监测

遗传数据为监测海洋哺乳动物种群提供了一个强有力的工具，但从一些较小的鲸类动物物种中收集必要的组织样本存在一定的困难。Scott等[46]2018年研究探索了使用eDNA 技术取样进行鲸类种群的遗传监测。这项研究是设计一种通过eDNA 方法生成小型和受威胁的海洋脊椎动物种群遗传数据方法的重要一步[47]。

定期进行经济高效的遗传监测被认为是两栖动物保护策略的一个基本方面。Lucia 等[48]2023年建立了一种基于eDNA 的池塘繁殖两栖动物物种内遗传多样性监测的有效方案，这是监测物种种群遗传多样性的可靠工具，对两栖动物保护和湿地管理具有极大价值。

2.5 疫病监测

Natividad 等[49]2008年建立了一种高灵敏度的二步巢式PCR 方法，用于检测池塘土壤中的对虾白斑综合症病毒（WSSV）DNA，这是第一个关于在土壤样品中检测WSSV DNA 的报告，首次记录了池塘土壤中WSSV 的存在。鲤科疱疹病毒3（CyHV-3）是一种致命的DNA 病毒，可感染普通鲤鱼和锦鲤。Honjo 等[50]2012年测试了从湖泊和池塘沉积物中提取CyHV-3 DNA 的方法，用实时荧光定量PCR 法测得CyHV-3 DNA 在沉积物中的浓度高于其在水中的浓度，表明沉积物在自然淡水生态系统中是CyHV-3 的潜在储蓄池，这是第一个在自然沉积物中检测CyHV-3 的报告，有助于更好地了解CyHV-3 在自然生态系统中的传播机制。雷纳病毒属病毒可感染两栖动物，但不会导致其死亡或表现临床症状。Miaud 等[18]2019年使用eDNA技术对法国南阿尔卑斯山感染雷纳病毒的普通蛙类（颞蛙）进行了测试，在6月繁殖季节和7月底这两个时间段的蝌蚪和水样中均检测到病毒DNA，证实eDNA 技术可以提高野生动物健康状况监测的性能和准确性，有助于更有效地开展监测和保护目标对象。Jørgensen 等[51]2020年提出了一种通过从养殖牡蛎或其种群的生活环境中采集水样来检测寄生性牡蛎包纳米虫（Bonamiaostreae）的eDNA方法。这种非致死性的eDNA 检测方法将有助于牡蛎的健康养殖。

2022年世界动物卫生组织（WOAH）水生动物委员会（AAC）在讨论性文件中提出：eDNA 方法的检测阳性结果可作为可疑病例的适当判定标准，该技术未来可发挥其优势，有望用于出入境检疫，以及养殖场、隔离场的食用、种用和观赏用等水生动物疫病监测[52]；eDNA 技术虽然仍存在一定局限性，但可适用于不同情形下的水生动物采样，有助于增强水生动物疫病的主动监测[53]。

3 基于eDNA 的水生动物疫病传播风险研究前景

近年来，有关eDNA 方面的研究报道从每年4篇（2012年）逐渐增加到28 篇（2018年），随后在2021年迅速增长到124 篇。eDNA 技术的发展被描述为一场“改变保护的安静革命”，在过去的十年中为生物监测及其所有衍生学科带来了巨大利益。eDNA 生物检测技术有可能成为评估地球所面临的众多人为和非人为压力源影响的最有效基础挖掘工具之一[54]。

水生动物一旦感染高致病性病原甚至是致死性病原，自然环境就会遭受严重破环，生态体系平衡就会被打破，这对于密集的大规模养殖模式，无疑将是沉重的打击。eDNA 技术是水环境疫病风险评估的重要手段，然而目前将其用于水生动物疫病传播风险的研究很少。

张娜等[55]2021年采用eDNA 方法对进口凡纳滨对虾携带的海水进行虾肝肠胞虫（EHP）风险评估，结果发现进口凡纳滨对虾亲虾携带病原的水体具有传播EHP 的可能性。Bernhardt 等[56]2021年开发并优化了健康蛙鱼与感染蛙鱼甲病毒（SAV）鲑鱼共居的实验模型，模拟了病毒传播，利用eDNA 技术检测海水中SAV 的携带情况，结果在水中和共居的健康鱼类器官组织样本中被先后检测到SAV，说明环境水可能是SAV 传播的感染源，且此方法可以作为检测大西洋鲑养殖场SAV 的一种替代方法，是一种更经济、直接、快速、可靠、可重复和对动物福利友好的方法。Yasuhiko 等[57]通过对海水进行eDNA 检测，对以真鲷（Pagrusmajor）幼鱼和亲鱼为主要养殖对象的养殖场开展了为期3年（2016—2018）的真鲷虹彩病毒（RSIV）传播风险研究，证实从感染RSIV 的无症状亲鱼身上脱落的病毒会水平传播给幼鱼，并导致养殖场进一步暴发RSIV 感染疫情。Yasuhiko 等[58]2023年通过检测养鱼场的eDNA 来检测RSIV 病毒载量，评估养殖场间环境水传播RSIV 的风险，发现RSIV 在养殖场之间的传播与网箱之间的距离密切相关，环境水并非是RSIV 在养殖场之间传播的关键感染源。

基于eDNA 技术有效、无创、快速、经济且易于标准化的众多优势，将其与水生动物疾病传播风险研究相结合，探索基于eDNA 的生物与生物、环境与生物之间的水生动物疫病传播机制，尤其针对感染后无明显致病性的水生动物将具有非常好的应用前景。早期研究[56，59-60]都是在体积小、海水相对干净的容器中进行的，未来可以做以池塘为基础的研究，以确定诸如池塘体积、池塘水质和养殖动物及环境生物行为等因素是否会影响eDNA 技术下的病原转移速率和成功率，为将eDNA 技术用于养殖环境下的水生动物疫病传播提供新的切入点。eDNA 技术的便捷可以更快速有效地检测并确定感染源，从源头有效遏制病原感染，切断其传播途径。同时也可开展水生动物疾病传播下的多病原分析，为eDNA 技术发展和疫病传播提供新的参考信息。

eDNA 技术也存在一定的局限性，会给实际应用带来挑战。eDNA 技术的灵敏度及定量效果会受到诸多因素影响，eDNA 样本的采集、提取和检测存在人为误差的干扰，且病原感染研究中必须防止外界环境污染或者样本间的交叉污染。与传统方式相比，该技术不能直接获取物种的死亡个体及性别比例等信息，因此制定通用的、标准化的eDNA技术操作流程是十分必要的，应在高度认识和掌握eDNA 技术的前提下开展更多的研究，为水生动物疫病监测提供更加可靠的技术支持。